重组人IL_31蛋白纯化方法的比较研究

15 中外医疗 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT 中外医疗 2008 NO.17 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT论 著 白介素31是美国ZymoGentics公司于2004年发现的一种新 的细胞因子,该基因的大小为904bp,其活性形式由141个氨基酸 残基组成的四螺旋单链结构。IL-31主要表达在活化的淋巴细 胞,在肾、骨髓、胸腺、小肠等组织中也由少量表达[1]。其信号 传导通过由IL-31受体alpha(IL-31Ralpha)和抑瘤素M受体 (OSMR)组成的异二聚体受体复合物,介导IEC中ERK-1/2、 Akt、STAT1和STAT3的活化。Sonkonly E等[2]研究表明,IL- 31与瘙痒性特应性皮炎的发生有一定关系,此类患者IL-31的表 达明显增高。另研究表明IL-31与支气管炎症、炎性肠病的发生 也具有相关性。因此,开发IL-31单克隆抗体或其信号阻断剂, 有可能成为治疗特应性皮炎等搔痒性皮肤疾病、哮喘等特应性 疾病的新切入点。本文在成功构建原核表达载体PET-32a/ rhIL-31基础上,对蛋白表达及纯化进行研究,不同的蛋白质的特 性不同,纯化条件也需要摸索,本实验采用两种层析方法IL-3进 行纯化,以期对蛋白纯化方法的选择及整体 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的制定提供一定 的指导。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 LB培养基 胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、蒸馏 水、调pH7.4。高压灭菌后加入抗生素保存备用。LB培养基购 自于Becton Dickinson公司。 1.1.2 菌株 含有pET32a/rhIL-31大肠杆菌E.coli.BL21 (DE3),由本室构建保存。 1.1.3 Ni-NTA琼脂糖凝胶FF柱 北京天来生物医学科 技有限公司。 1.2 方法 1.2.1 细菌的培养及rhIL-31的诱导表达 将含有pET32a/ rhIL-31的BL21(DE3)菌株接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB 固体培养基上,37℃培养过夜,挑取单个克隆接种于5mlLB液体 培养基上,37℃200r/m振荡培养12～16h后,倒入500mL含 100mg/L的Amp LB培养液的锥形瓶中,37℃条件下200r/m培 养至OD600约为0.6h,采集1mL菌液于EP管中,10000rpm 5min, 去上清,加等体积2倍上样缓冲液,沸水中煮5min,4℃保存,剩余 菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃条件下振荡培养6h。 1.2.2 大肠杆菌包涵体的分离 收集500mL诱导表达的工 程菌,10000rpm/min 10min离心去上清,加三倍体积的细菌裂解 液,-20℃冻存过夜,超声破碎10000Hz每次10s,40min后,离心去 上清,用含2M尿素和Triton-x100的PBS洗涤2次,离心收集沉 淀即得包涵体。将包涵体用8倍体积的8M尿素室温下磁力搅拌 24h溶包,离心留上清即为溶解的包涵体。 1.2.3 rhIL-31的纯化 (1)凝胶层析分离纯化将sephadex G-75充分溶胀后,将层析柱装好,取包涵体溶解液1mL上样,用 PBS洗脱,纳氏试剂、双缩尿试剂检测洗脱液中氨根离子和蛋白 质,收集含蛋白质的洗脱液,SDS-PAGE检测。(2)亲和层析分离纯 化镍琼脂糖凝胶FF装柱,1.6cm×20cm,柱床体积为10mL,用平 衡缓冲液平衡2～5个床体积,流速为2mL/min。取1mL包涵体溶 解液上样,流速为1mL/min。用平衡缓冲液再洗2～5个床体积,流 速为2mL/min,用分别含10﹑20﹑50﹑100﹑200mmol咪唑洗脱 液进行阶段洗脱,流速为2mL/min,收集各阶段洗脱峰,SDS-PAGE 检测。 ①贵州省社会发展课题项目资助(NY20063039) 重组人IL-31蛋白纯化方法的比较研究① 余妍 孙万邦 刘曦 (广东省遵义医学院珠海校区免疫学教研室 广东珠海 519041) 【摘要】目的 比较两种方法纯化rhIL-31的效果。方法 将含pET32a/rhIL-31的重组菌E.coli.BL21(DE3)经IPTG诱导表达,通 过超声波破碎,包涵体的提取溶解,分别经G75凝胶层析和镍琼脂糖凝胶FF层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE对纯化结果进行比较分 析。结果 镍琼脂糖凝胶FF层析法的杂蛋白去除率高于凝胶层析法,所得蛋白纯度略高。结论 比较重组人IL-31蛋白的纯化效 果,镍琼脂糖凝胶FF层析的效果比G75凝胶层析的效果好。 【关键词】重组人IL-31 G75凝胶层析 镍琼脂糖凝胶FF层析 【中图分类号】R392.11 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0742(2008)06(b)-0015-03 Purification of Recombinant human IL-31 Protein by two Methods YU Yan SUN Wanbang LIU Xi Zhuhai Campus of Zunyi Medical College,Guangdong 519041,China 【Abstract】 Objective To compare the purification effects of rhIL-31 by two methods.Methods pET32a/rhIL-31 in E.coli.BL21 were expressed when induced by IPTG,E.coli cells were broken by ultrasonic,the inclusion bodies were solvated in urea,further purified respectively by sephadexG-75 gel chromatography and Ni-NTA agarose F.F.,and recombinant human IL-31 protein concentration was determined by SDS PAGE.Results The removal rates of foreign protein of rhIL-31 purified by sephadexG-75 gel chromatography were slightly higher than that by Ni-NTA agarose FF.Conclusion Compared the rhIL-31 protein purificate effection, the Ni-NTA agarose F.F.were more suitable than sephadexG-75 gel chromatography. 【Key Words】 rhIL-31;SephadexG-75 gel chromatography;Ni-NTA agarose FF 16 中外医疗 中外医疗 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT 2008 NO.17 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT 论 著 2 结果 2.1 PET32a/rhIL-31诱导表达SDS-PAGE 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 经SDS-PAGE鉴定,分子量在34kd处可看见目的条带,而未 经诱导的菌株培养物未见特异性条带,结果见图1。 Fig.1 SDS-PAGE analysis of expressive products in combined E. coli.BL21(DE3) M:protein marker;1:induced for 6h;2:before induction 2.2 rhIL-31凝胶纯化的SDS-PAGE分析 经G75凝胶层析纯化后的目的蛋白SDS-PAGE分析,结果见 图2。在34kd处有目的蛋白,目的蛋白的上方有杂蛋白条带。 Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressive products after purification by sephadexG-75 gel chromatography 2.3 rhIL-31亲和层析纯化的SDS-PAGE分析 目的蛋白经镍琼脂糖凝胶FF纯化后SDS-PAGE分析,结果 见图3。50mM咪唑洗脱液中有杂蛋白(图A),100mM、200mM咪 唑洗脱液中有目的蛋白(图B)。过柱前后样品SDS-PAGE分析, 结果见(图C) Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressive products after purification by Ni-NTA agarose F.F. A:foreign protein was washed by 50 mM imidazole; B:objective protein was washed by 100 mM imidazole and 200 mM imidazole; C-M:mark C-1:emanative liquid after purification C-2: inclusion bodies before purification 3 讨论 层析法又称色层分析法或色谱法(Chromatography),它是在 1903年至1906年由俄国植物学家M.Tswett首先系统提出来。层析 技术应用于蛋白质的分离纯化开始于60年代,现已成为蛋白质分 离纯化的高分辨率的方法[3]。本试验包涵体的纯化采用Sephadex G-75和Ni-NTA-Agarose两种层析方法,各加一定量的包涵体 溶解液,并按各自缓冲液对介质清洗后洗脱蛋白,剩余液体和洗 脱液进行SDS-PAGE分析,以选取蛋白质纯化的较好方法。 凝胶过滤层析是基于液相的分离方法。在凝胶层析中,由于 凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质,当带有多种成分的样 品溶液在凝胶内运动时,由于它们的分子量不同而表现出来的快 慢,在缓冲液洗脱时,分子量大的物质不能进入凝胶孔内而在凝 胶间几乎是垂直的向下运动,而分子量小的物质则进入凝胶孔内 进行“绕道”运行,这样就可以按分子量的大小,先后流出凝胶 柱,达到分离的目的。凝胶层析的优点:①操作简便,所需设备简 单,不需要进行复杂的介质再生;②分离效果较好,重复性高,样 品回收率接近100%;③分离条件缓和。不涉及化学键变化,所以 对分离物的活性没有不良影响;④应用广泛,适合各种生化物质, 如肽类、蛋白质、多糖、核酸等的分离纯化、脱盐、浓缩以及 分析测定等。分离的分子量范围也很宽。其缺点是:分辨率不 高,分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分 离依据的,分子量的差异仅表现在流速的差异上,所以分离时流 速必须严格把握,因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差 不多的物质难以达到很好的分离。此外凝胶层析要求样品粘度 不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。本实验中的目 的蛋白经SDS-PAGE分析,有些杂蛋白的分子量和目的蛋白很接 近,因此可能会影响分离效果。另外有较多大的杂蛋白菲特异性 的结合到Sephadex G-75介质上,也会对纯化效果有影响。 亲和层析是通过将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不 溶性基质上,利用分子间亲和力的特异性和可逆性,对另一个分 子进行分离纯化。选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作 为配体结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和吸附剂装柱 平衡,当样品溶液通过亲和层析柱时,待分离的生物分子就与配 体发生特异性的结合,从而留在固定相上,而其它杂质随洗脱液 流出,达到分离的目的。亲和层析的优点:①是分离蛋白质的一 种极为有效的方法,只需经过一步处理即可将目的蛋白从很复杂 的混合物中分离出来,而且纯度很高;②是最有效的生物活性物 质纯化方法,它对生物分子选择系吸附和分离,可以取得很高的 纯化倍数。此外蛋白质在纯化过程中得到浓缩,结合到亲和配基 后,性质更加稳定,其结果提高了活性回收率。它可以减少纯化 步骤,缩短纯化时间,对不稳定蛋白的纯化十分有利。其缺点是: ①除特异性吸附外,仍然会因分子的错误识别和分子间非选择性 的作用力而吸附一些杂蛋白,另外在洗脱过程中的配体不可避免 的脱落进入分离体系;②载体较为昂贵,机械强度低,配基制备困 难,有的配基本身要经过分离纯化,配基与载体偶联条件激烈等。 本实验中的原核表达载体。PET32a/rhIL-31表达的目的蛋 （下转18页） 18 中外医疗 中外医疗 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT 2008 NO.17 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT 论 著 3.4 两组治疗前、后心电图变化见表3 表3示,早搏、缺血性ST-T,两组相比差异有显著性(P<0.05)， 有统计学意义。由于传导阻滞病例较少,未进行统计。 表3 两组治疗前后心电图变化比较 3.5 两组治疗前、后心肌酶变化比较 表4示,两组治疗后比较,差异均无显著性(P>0.05)。 3.6 两组治疗前、后血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA) 和自然杀伤细胞(NK细胞)变化比较 表5 两组治疗前后SOD、MDA、NK细胞变化比较( ±s) 后心悸、胸闷、胸疼、气短、乏力等征状均可以明显缓解,心电 图明显改善,心肌酶趋于正常,NK细胞与SOD活性增强,且能降 低MDA,减少自由基对心肌细胞的攻击,说明解毒涤痰汤可使正 常的心肌细胞得到保护,受损的心肌细胞得到修复。 目前认为病毒性心肌炎的发病机制包括两个阶段:第一阶段 是病毒经血液直接侵犯心肌的作用;第二阶段主要是病毒介导的 免疫变态反应损伤心肌。心肌酶的升高是心肌损伤的重要标志。 解毒涤痰汤能显著降低心肌酶,提高NK细胞的活性,说明其具有 拮抗病毒对心肌损伤的作用和病毒性心肌炎患者的免疫调节作 用,脂质过氧化机制与心肌损伤的关系已被证实[4]。 参考文献 [1] 全国心肌炎心肌病专题研讨会.成人病毒性心肌炎诊断参考标 准[J].临床心血管杂志,1995,11(6):325～326. [2] 中华人民共和国卫生部.中药新药临床研究指导原则[M].北京: 白含有6个组氨酸融合标签,利用金属镍与6-His tag之间的亲 和性,通过在蛋白质的N端/C端加6～10个组氨酸,8M尿素借 助它能与镍离子螯合柱紧紧结合的能力,用咪唑洗脱,或将pH降 到5.9使组氨酸充分质子化,不再结合镍离子,从而将带有6-His tag的融合蛋白质纯化出来,用Ni-NTA树脂亲和层析法可以从 包涵体溶解物中分离得到纯度交给的IL-31,提高了纯化效率。 本次试验从纯化效果来看,Ni-NTA-Agarose层析优于Sephadex G-75。在今后的实验研究中,考虑利用多种蛋白质纯化方法进行 筛选,以达到最佳的提纯效果。 参考文献 [1] Dillon SR,Sprecher C,Hammond A,et al.Interleukin 31,a cytokine produced by actived T cell,induces dermatitis in mice[J].Nat Immunol,2004,5:752～760. [2] Sonkoly E,Muller A,Lauerma AI,et al.IL-31:A new link between T cells and pruritis in atopic skin inflammation[J]. J Allergy Clin Immunol,2006,117(2):411～417. [3] 杨立红.生物化学学习指导[M].北京:科学出版社,2006:21～40． [4] Choi NS,Chang KT，Maeng P.J.Cloning,expression,and fibrin(ogen) olytic properties of a subtilisin DJ-4 gene from Bacillus sp[J].DJ-4,2004,236(2):325～331. 【收稿日期】2008-05-05 （上接16页） 表4 两组治疗前后心肌酶变化比较(U/L,±s) 注:与本组治疗前比较,△ P＜0.05;与对照治疗后比较,*P＜0.01;下表同 人民卫生出版社,1993：46. [3] 陈可冀.心血管病研究[M].上海:上海科学技术出版社,1998： 300～301. [4] 赵美化.生脉散对急性病毒性心肌炎患者血清脂质过氧化的影 响[J].中国中西医结合杂志,1996,16(3):142～146. 【收稿日期】2008-05-07 表5示,治疗组治疗前、后相比差异有显著性(P<0.01);对照 组治疗前、后相比差异无显著性(P>0.05)。而两组间比较差异有 显著性(P<0.01)。 4 讨论 本研究表明,治疗组总有效率93.5%,明显优于对照组,治疗