nullnull实验二 革兰氏染色法null一、目的
要求
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了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。null二、基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阳性细菌，用G+
表
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示；革兰氏阴性细菌，用G-表示。由于细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 nullnull三、器材
大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；
革兰氏染色液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain） ，载玻片，显微镜等。null四、操作步骤
1．涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2．染色
（1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 null2．染色
（1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染 用番红液染1—2分钟，水洗。nullnull （5）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。null五．思考
题
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（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？
（3）若将初染液和复燃液调换使用，染色结果是否也是相反的？为什么？
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