实验十五 氨基酸的纸层析

实验十五 氨基酸的纸层析和电泳 实验十五 氨基酸的纸层析 一、实验目的： 1、学习氨基酸纸层析法的基本原理；  2、掌握氨基酸纸层析的操作技术。 二、实验原理： 层析分离技术是利用被分离的混合物中各组分物理化学的性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相（流动相和固定相）中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离。 层析分离技术在20世纪初就已得到应用；1903年用于植物色素的分离；1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；1944年出现了纸层析。 层析分离的种类很多，按流动相的状态可分为液相层析和气相层析；按固定相的使用形式可分为柱层析、纸层析和薄层层析等； 按分离过程所主要依据的物理化学性质可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等。 用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示： 只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。 样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。 氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 三、仪器与试剂： 1、实验仪器 新华1号滤纸、烧杯100ml(×1)、剪刀、层析缸（×2）、微量注射器10ul(×1)或毛细血管、电吹风（×1）、722型分光光度计、指套或橡皮手套 2、实验试剂 (1) 混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉) 甘氨酸溶液：50mg 甘氨酸溶于5mL 水中。 蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶于5mL 水中。 亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶于5mL 水中。 氨基酸混合液： 甘氨酸50mg，亮氨酸25mg，蛋氨酸25mg 共溶于5mL 水中。 (2)溶剂系统 碱相溶剂：V[正丁醇（A.R.）]:V(12％氨水):V(95％乙醇)=13:3:3 酸性溶剂: V[正丁醇（A.R.）]:V(80％甲酸):V(水)=15:3:2， 摇匀后放置半天以上，取上清液备用 (3)显色贮备液:V(0.4 mol•L-1茚三酮-异丙醇):V(甲酸):V(水)=20:1:5. (4)V(0.1％硫酸铜:V(75％乙醇)=2:38溶液，现配现用。 四、操作步骤： 1、单向层析 (1)滤纸准备：选用新华1号滤纸，裁成22cm×28cm的长方形，在距纸一端2cm处划一基线，在线上每隔2～3cm，画一小点样的原点，共4个点。 (2)点样：氨基酸点样量以每种氨基酸含5～20ug为宜，用微量注射器或微量吸管，分别吸取三种标准氨基酸溶液和氨基酸混合液10ul进行点样，中间的点混合氨基酸，两侧点三种标准氨基酸；每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径应控制在2mm左右。 (3)展层和显色：点样完毕用大头针或者白线（缝）将滤纸做成筒形，点样面向外,注意纸的两边不要接触，原点在下端，浸立在培养皿内，不需平衡，立即展层，展层剂为酸性溶剂系统[V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15:3:2]，把展层剂混匀，倒入培养皿内，同时加入显色贮备液(每10ml展层剂加0.1～0.5ml的显色贮备液)进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1～2cm时，取出滤纸，吹干，层析斑点即显蓝紫色。用铅笔划下层析斑点，测量原点到各层析斑点中心的距离以及原点到溶剂前沿的距离，可进行定性、定量测定。 2、混合氨基酸双向上行纸层析（选做） (1)滤纸准备：将纸裁成28cm×28cm正方形，距滤纸相邻两边各2cm处的交点上，用铅笔轻划一点，作点样用。 (2)点样：取混合氨基酸溶液(5mg/ml)10～15ul，分次点于原点。 (3)展层和显色：将点好的滤纸卷成半筒纸，用白线缝好，竖立在培养皿中，原点应在下端。置少量12%氨水于小烧杯中，盖好层析缸，平衡过夜。次日，取出氨水，加适量碱相(第一向)溶剂于培养皿中，盖好层析缸，上行展层，当溶剂前沿距滤纸上端1～2cm时，取出滤纸，冷风吹干。用铅笔划下层析斑点，测量第一向展层原点到各层析斑点中心的距离以及原点到溶剂前沿的距离。将滤纸转90度，再卷成半圆筒状，竖立于干净培养皿中，并于小烧杯中置少量酸相溶剂，盖好层析缸，平衡过夜。次日将加有显色剂的酸相溶剂(每10ml展层剂加0.1～0.5ml显色贮备液)倾入培养皿，进行第二向展层。展层毕，取出滤纸，用热风吹干，蓝紫色斑点即显现。用铅笔划下层析斑点，测量第二向展层原点到各层析斑点中心的距离以及原点到溶剂前沿的距离。 五、 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 ： 1、取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；如条件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在洁净的滤纸上，不可放在实验台上，以防止污染。 2、点样点的直径不能大于0.5cm，否则分离效果不好，并且样品用量大，会造成“拖尾巴”现象。 3、在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点（原点）要高于培养皿中扩展剂液面约1cm。由于各氨基酸在流动相（有机溶剂）和固定相（滤纸吸附的水）的分配系数不同，当扩展剂从滤纸一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离。 六、数据处理： 1、单向层析的Rf 值，按 “Rf  = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离”计量后计算。 2、双向层析Rf 值，由两个数值组成，在第一向计量一次，第二向计量一次，分别与已知的氨基酸在酸碱系统的Rf 值对比，即可初步决定它为何种氨基酸的斑点，将它剪下，在同一张纸剪下一块大小相同的空白纸作为对照，用硫酸铜—乙醇溶液洗脱，用722型分光光度计测定其吸光度，在标准曲线上查出氨基酸的含量。 七、思考题： 1、纸层析法的原理是什么？ 2、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 3、什么是“拖尾巴”现象？氨基酸纸层析为什么会出现拖尾现象？ 思考题 答案 八年级地理上册填图题岩土工程勘察试题省略号的作用及举例应急救援安全知识车间5s试题及答案 ： 1、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。 2、Rf  = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离；在一定条件下某种物质的Rf值是常数，Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 3、拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。出现的拖尾现象的原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上所致。