生物制品活性质控的思考

, 中国新药杂志 年第 卷第 期 尹 , , , , , 》 》 , , 》、 二 论 坛 、《 《 《 《 《 《 ⋯沪 生物制品活性质控的思考 罗建辉 , 张克坚 国家食 品药品监督管理局 药品审评 中心 , 北京 关键词 〕 生 物制 品 生物活 性 质量控制 【中图分类号 」 文献标识码 」 文章编号 一 一 一 生物制品是应用普通 的或 以基 因工程 、 细胞工 程 、 蛋 白质工程 、 发酵工 程等生物技术 获得 的微生 物 、细胞及各种动物和人源 的组织和体液等生物材 料制备 , 用 于人类疾病预防 、 治疗和诊断的药品〔‘ 〕。 生物制品与化学药物一样需要对结构 、鉴别 、 纯 度 、 含量等理化指标进行控制 。 研究发现 , 同样的原 材料和分离纯化工艺 , 在理化检测分析结果基本相 同时 , 获取的原液却表现 出生物活性 的差异 。 目前 的理化分析项 目还不能检测 出批 间的细微差异 , 因 此 , 仅靠理化检测分析指标还不能有效控制产 品质 里 鉴于生物大分子研究 的难度 , 有 的还带有复杂 的修饰基团 , 目前的技术分析研究手段 尚未达到能 够揭示 出其全部特征或活性作用全程的阶段 , 分子 结构 中影响功能活性 的决定基 团 尚不 明确 , 难 以找 到特定 的理化性质检测指标与生物活性控制之间的 对应关系 , 并建立起 内在的必然联系 , 而活性作用 的 存在又是实现药效作用的前提和基础 , 因此 , 生物制 品应 当进行特定生物活性 的测定 。 本文拟就生物制 品活性含义 、生物活性 的细胞 和动物实验测定方法 、 测定结果 的变异性及活性测 定 的规范化等与生物活性质控有关的方面进行粗浅 的分析 , 以正确理解和认识生物活性及其测定 结果 所能够揭示和反映的产品质量方面的特性 。 对生物制 品活性含义的理解 生物制品活性与生物体内各种复杂的功能活动 有密切 的联系 , 我们一般将生物制 品的活性理解 为 来源于生物体 , 能够在人体内表现或 者诱导出特定 的生物反应 、应答和效应 。 生物制 品的药效作用建 立在特定的生物活性基础上 , 例如胰 岛素降低血糖 的作用 , 疫苗诱导 出的特异性免疫应答 , 单克隆抗体 与对应表位结合后 引起 的后续效应 , 干扰素抑制病 毒增殖和调节免疫应答等 。 生物活性作用 的特点 作用方式多样 有直接作用 , 也有 间接作用 有特异性作用 , 也有非特异性作用 可 以表现为激活 效应 , 也可 以表现 为抑制效应 可 以是单独作用 , 也 可 以是协同作用 。 作用机制复杂 可概括为通过调动生 物活性 分子之间 、生物活性分子与细胞之 间甚至细胞 之 间 的相互作用来传递生 物信息 , 调节或者影 响细胞生 命活动的过程 。 在生 物活性发挥作用 的过程 中 , 涉 及的中间环节较多〔 〕。 由于生物活性作用的复杂性 、多样性 , 因此在特 定的情况下有时还可能需要选定多项活性指标 以更 有效控制产品的质量 , 此时精确测定和分析活性变 得更加复杂和 困难 , 创新性生物制 品和 多组分制品 尤其如此 。 生物活性控制指标 、特点及方法 总体考虑 应 当从限定来源材料 、严格控制提 取和纯化过程开始控制生物制品的活性 。 产品应经 过结构确认 , 保持稳定的工艺 , 活性测定方法经过验 证 , 充分考虑生物活性质控 的要点 , 并建立活性相关 的检测指标和活性对照 品 。 鉴于生物制品活性本身和生物活性测定方法的 变异 , 特别是选择和使用活细胞 、 活动物时 , 难 以做 到不 同批 次完全一 致 , 因此 必须建 立参 比品 标准 品 , 以控制不 同批次之间活性测定的一致性 〔 」。 生物活性是在特定条件下对药效特征的一种基 本衡量和评价 。 多种 因素可 以影响每批测定结果之 间的一致性与可 比性 。 通过重复和验证的方法才能 够有效控制变异因素 , 在一定范 围内建立起可控 的 活性大小的评价指标 。 在作用机制 明确的前提下 , 一般选择特征性作用环节作为测定生物活性效能的 指标 , 例如抗体的亲和力和结合的特异性 。 生物大分子 由于结构的改变 、修饰 的不 同 、 同源 性的差别 、不同的突变 、 截短 、 甚至 聚合 状态不 同等 均有可能导致 活性 的差 别 。 因此 , 生物制 品表现 出 一 一 , 的活性 , 在多数情况下 实际上是一组 同类物或者相 关物质所共同反映出的综合活性 。 现有手段 目前还 难以将不 同的相关物质鉴别 出或者完全 区分开 , 生 物制品批与批之 间的变异性 、组成上 的相对不均一 性及活性谱的不一致性使生物活性质控的难度和复 杂性加大 。 如何确定某一特定分子就是具有那种活性 的分 子 只能依靠将分子纯化至均一 的最终证据 「 〕。 对于创新生物制品 , 在 尚未经过临床验证和作 用机制不明的情况下 , 通常难 以推测选定 的生 物活 性控制相关指标与临床实际疗效之间的 内在联 系 , 活性质控指标选择 的合理性 、 适用性和代表性都有 待验证 。 因此生物活性控制指标也可 以是与药效作 用相关或者相伴随 的特定活性 , 随着人们对生物活 性与药效作用认识的深人而不断修订和完善 。 生物制品活性相关的定性 、 定量分析研究 定 性鉴别试验是对生 物制 品定性确认 的前提和 基础 , 因此应首先对生物制品是否含有特定的生物分子进 行鉴别分析 , 特别是对于创新性生物制品 , 由于选定 的生物活性控制相关指标可能是与药效作用相关或 者相伴随的生物活性 , 要 明确生物制品是否含有真 正的药效作用分子 , 通常多采用 免疫学结合试验进 行初步鉴别 , 鉴别结果 的正确性 以选用 的抗体的正 确性为先决条件 。 因此 , 对 于选择 的检测抗体必须 有充分的验证资料证 明其结合 的特异性 , 检测方法 应具有适宜的特异性 、灵敏性 。 生物活性 的定量 检测主要是通过剂量 一效应关 系建立起适宜的数学模型 , 借助标准品 参比品的对 比来测定 , 一 般表示 为生 物制 品活 性 的相对效力 。 细胞试验和动物实验测定活性方法应用较多 。 细胞及动物测 定 活性方法 生物制 品活性测 定有多种方式 、 方法 。 其 中以细胞活性 、 动物活性测 定法应用最多 , 其结果可用 于直接反 映生物制品的 特点和药效作用 。 一般是通过测定活细胞或者动物 等生命体的特异或者非特异效应或者应答变化的程 度 、 强度等进行定量分析 。 作 为活性生命体的细胞 , 其本质特征之一就是 自身处于不断的动态变化 当中 , 在相对的平衡 和有 规律中被各种不稳定 因素所调节 , 由此带来 了由于 方法学试验对象的易变等因素引起 的细胞或动物活 性测定方面的复杂性和特殊性 。 因此应用这类方法 必须经过验证 , 而且必须建立相应 的测活对照品 , 通 过与参 比品 标准 品 比较确定生物制 品的相对生物 活性 。 一 一 中国新药杂志 年第 卷第 期 鉴于细胞法 和动物法本身固有 的较大变异性 , 因此在拟订生物制品规格时应注意活性变异导致 的 临床用药规格不合理问题 , 比如将活性质控 的 可信限范围定 为 一 , 申请标示 活性 分别 为 , 及 等多个规格 , 如果将 规格生物制品分别按活性许可 的高限与低限进行换 算 , 其实际活性则与 及 规格很可能没 有本质区别 , 出现不 同规格生物制品活性 范 围交叉 的现象 , 临床使用后必然会影响疗效判断 , 难 以确定 正确的使用剂量 。 因此在 申请临床研究用药的规格 时应充分考虑上述问题 。 生 物活性测定 的研究应贯 穿于研发 的整个过 程 , 作为评价质量的核心指标 , 在研发阶段可以选择 和建立多个活性测定项 目 , 从不 同的角度和侧 面来 衡量活性 的特点和规律 。 但作为常规的生物活性质 控项 目应选择稳定 、误差小 、 可控性强的活性测定方 法 。 在早期定性和鉴别阶段则侧重于提示和发现生 物活性相关的信息 , 精确性和准确性可 以放宽 , 进人 临床研究的产品应建立适宜的方法和测定 的许可范 围 , 保证临床研究用药生物活性的基本一致性 , 尽量 缩小波动范围 在生产中必须建立标准品 , 进一步严 格建立方法学的控制条件 , 保证产品活性测定结果 的稳定性 、 不 同批次产品测定结果的一致性 , 最好能 反映和预测潜在的临床疗效 。 参 比品 标准品对测定活性的重要性 通过与 参 比品 标准品 比较可 以测 定相对活性而 不是绝对 活性 , 可使试验结果具有相对一致性和可 比性 。 在参 比品伟示准品的对照下 , 如果待测样本在剂 量 一效应关系中表现出相似性和高度拟合性 , 表 明样 本中的活性基本可看做是参 比品 标准品 的活性稀 释而来 , 但前提是两者除对特定的同质生物活性 成 分含量不 同以外 , 在其他方面包括可 能 的干扰性 杂 质等均应基本相同 。 剂量 一效应关系的相似性 、拟合度还应经过统计 学有效性检验 , 证 明两者反 应模式 的相 对一致性和 一致性的程度是否在许可的范围内 , 以及参 比品 标 准品的剂量 一反 应关系能 否用 于推算样本 的生 物活 性 。 在严格控制试验成立 的基本要求条件后 , 应进 行多次重复测定 , 算出均数和标准差 , 与对照 比较后 才能得出相对准确的生物活性 。 生物活性的标示 生物活性应采用 比活性衡 量 , 即单位质量 的生 物制 品 中含有 的生 物学 活性 。 如果单用活性评价 , 可 能会 出现不 同批 次的制 品虽 然具有同样的活性但质量不 同 , 因此单用 活性 而不 中国新药杂志 年第 卷第 期 测定结果波 动大 , 变异 因素 多 , 因此必 须对 试 验条 件 、检测规范及活性变异范围建立起适宜的控制要 求 。 只有经过方法学验证和 统计学分析 比较 , 才能 明确正常许可 的波动范 围 , 从而制定 出合理 、 可行 、 可控的活性测定方法 , 避免干扰因素的影响 。 结语 由于生物大分子 固有 的复杂性 , 现有 的技术手 段尚难以完全鉴别 、 分离及纯化 出特定生物活性物 质中每一种具体 的活性分子 的各种实体 , 特 别是能 够应用到大规模产业化 的制备程度 。 因此 , 活性测 定只能是利用现有可获得的技术手段对主要的活性 成分实体进行适宜的控制 , 对尚不 能够确定的成分 进行适 当限制 , 结合临床前 的动物实验研究结果进 行综合分析评价 , 增加可预知性 , 减少风险性 , 通过 临床研究的实践进一 步明确作用 的规律 和特点 , 从 而更好地为临床服务 。 作者简介 〕 罗建辉 一 , 男 , 硕 士 , 从事生 物制 品 技术 审评 。 联 系 电话 一 , 一 · 通讯作者 〕 张克坚 一 , 男 , 博士 生导 师 , 从 事药 品 技 术审评 及 管理 。 联 系 电话 , 一 。 参 考 文 献 中国生物制品标准化委员会 中国生物制品规程 〔 】北 京 化 学工业 出版社 , 汪 望 仁 , 薛绍 白 , 柳惠图 细胞生 物学 「 第 版 北 京 北 京 师范大学 出版社 , , 王 军志 生物技术药物研究开发 和质量控制 〕北京 科学 出 版社 , 一 朱厚础 蛋 白质纯化与鉴定 实验指南 北 京 科学 出版社 , 陈惠黎 生物大分子 的结构和功能 上海 上海 医科大学 出 版社 , 一 , 一一一一飞刁门一一」伪乙,、月一︶ 广一一一一厂一一七厂一一一 , 考虑质量 时不 能够充分反 映活性 构成 比的具体情 况 。 生物制 品一般应采用质量和活性双标示 。 生物活性物质 的保存 条件 由于生物制 品来 自于生物体 , 活性 的产生 和 维持依赖于 比较温和 的 体内环境 , 一般以 多肤或者蛋 白质 为基础结构和组 成成分 , 对体外理化 因素的改变 比较敏感 。 生 物制 品在非生物体内的 自然环境 中 , 如果不加 以适 当保 护 , 则容易不可逆地失去上述特殊功能作用和性质 , 因此在生产工艺过程中一般需采用类似于体内的温 和处理条件和特殊提取 、 纯化步骤 以 减少对生物活 性的破坏 , 生物制品一般需要在低温 、冻干 、避光 、 密 封下贮存 , 并需要加人稳定剂给予适 当保护 。 影响生物活性测定的因素 生 物 制 品 内在影 响因素 包括结构 、 修饰基 团 、修饰的位点 、修饰 的均匀度和一致性等 。 鉴于生 物大分子的活性与结构之间关系复杂 , 因此应注意 同类物的构成和特征 的分析研究 , 例如糖基化修饰 例如 细胞 、 酵母 菌表达产 品 影 响制 品生 物 活性时 , 应制定更严格 的活性质控要求 。 同时还需 要使用其他辅助检测 、 分离或鉴别 的高级手段进行 更深人 的研究 , 从糖基化位点 、 糖的种类和含量 、 糖 链的长度 、分枝数 天线数 等影 响活性 的特征性 因 素进行分析 , 在此基础上才能建立 有效 的复杂质控 要求 〔“丁。 测定活性时的外在 因素 包括测定 系统 的稳 定性 、测定活性的外在控制条件等方法学验证方面 应考虑的各种变异 因素 。 如果检测系统的可变性与 测定时的变异性偶合在一起 , 将会导致变化 的幅度 和范围加大 , 难 以准确测定 , 多个 因素处于变化和不 确定状态作用 的结果必然表现 为偶 然性 占主导地 位 , 使试验结果 出现极端的偏移 。 特别是 细胞 法 和 动物 法 , 外 在 因素影 响更 大 。 由于方法学和试验对象 固有 的易变性 , 这两类方法 接受 日期 一 一 论医药产业 区域创新系统的构建 于 海‘ , 黄泰康 , 吴春福‘ 沈阳药科大学 , 沈 阳 中国 医药科技 出版社 , 北京 〔关键词 」 医 药产业 区域创新 系统 构建 【中图分类号 文献标识码 」 【文章编号 〕 一 一 一 国家创新系统理论研究 已取得 了重大进展 , 它 强调一个 国家范 围的创新活动 , 往往忽视 了次一级