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GB 19440-2004 禽流感病毒NASBA检测方法.pdf

GB 19440-2004 禽流感病毒NASBA检测方法

永恩
2010-10-22 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《GB 19440-2004 禽流感病毒NASBA检测方法pdf》,可适用于农林牧渔领域

ICSB中华人民共和国国家标准GBT禽流感病毒NASBA检测方法protocolofdetectingavianinfluenzavirususingNASBA发布实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局国家标准化管理委员会发布GBT前言禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型流感病毒引起其中高致病性禽流感因其传播快、危害大世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疾病我国将其列为一类动物疫病。依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当并具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。本标准是在综合我国科研成果的基础上参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》(年版)并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准附录A、附录B为规范性附录附录C为资料性附录。本标准由上海市质量技术监督局和上海出入境检验检疫局提出。本标准由国家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位:上海出入境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片开发有限公司。本标准起草人:单松华、刘乐庭、倪旦红、胡永强、李树清本标准系首次发布的国家标准。GBT禽流感病毒NASBA检测方法范围本标准规定了NASBA快速检测禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定。本标准适用于禽类、禽肉产品中所有亚型禽流感病毒的快速检测、诊断。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准然而鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件其最新版本适用于本标准。GBT-高致病性禽流感诊断技术原理NASBA(Nucleicacidsequencebasedamplification,NASBA依赖核酸序列的扩增技术)是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶(反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T核糖核酸聚合酶)和两条寡核苷酸引物。上游引物’末端含有噬菌体T的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子序列下游引物的’末端含有和钌标电化学发光检测探针互补的序列。在扩增步骤中两个’端都整合进扩增序列中这样既成为产生互补RNA序列的模板又能特异性结合检测步骤中的ECL探针。扩增底物与ECL探针形成复合物携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光(ECL)反应。已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应。材料准备试验环境干净的环境最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区。器材采用常规的分子生物学器材包括:一次性手套、移液器(量程µL到µL)、枪头、无RNA酶的mL塑料离心管、mL离心管架、mL试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计(精度±°C)、加热器、水浴锅、mL聚丙烯试管(VWR)、封口膜。如果采用ECL方法需要NucliSens阅读器或者其他等同仪器。如果采用ELISA方法需要酶标仪。GBT引物上游引物AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGA(AG)GGCATT(CT)TGGACAAA(GT)CGTCTA下游引物GATGCAAGGTCGCATATGAGGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGAC检测试剂:所有检测试剂在使用前使其达到室温。a)裂解缓冲液(lysisbuffer)(M异硫氰酸胍TritonXmMTrisHCl)b)冲洗缓冲液(washbuffer)(M异硫氰酸胍mMTrisHCl)c)mgmL硅土(Silica)(mgml盐酸活化的二氧化硅)d)洗脱缓冲液(elutionbuffer)(mMTrisHCl)e)酶溶液(见附录A)f)H捕捉探针(Hcaptureprobe)(mM生物素化寡聚核苷酸)探针序列为BiotinCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAg)电化学发光法属别检测探针(mMgenericECLdetectionprobe)(钌标记的DNA寡聚核苷酸)ECL序列为GATGCAAGGTCGCATATGAGCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTAh)仪器调试参照液(instrumentreferencesolution)i)检测稀释液(detectiondiluent)(mMTrisHCl)j)分析缓冲液(assaybuffer)(mMTrisHCl)k)清洗液(cleanersolution)(mMKOH,SDS,TritonX)l)无水乙醇(alcohol)。样品采集、保存、处理按GBT-中款进行。操作方法核酸释放和提取按以下顺序:a)将mL样品加入盛有mL裂解缓冲液的管中并振荡混合b)振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加入μLc)振荡混合均匀d)室温下温育min(每min振荡混合一次防止硅土沉淀)GBTe)在,rmin下离心裂解缓冲液管secf)小心移除上清液(不要搅动沉淀)后向每个管中加入mL冲洗缓冲液g)振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止h)在,rmin下离心sec然后移除上清液i)重复第f)步到第h)步的步骤。依次为一次使用冲洗缓冲液两次使用%乙醇最后一次使用%乙醇j)最后一次洗涤步骤后用移液器小心移除残余乙醇k)使用加热器在℃敞口干燥硅土min(用薄纸覆盖每个管避免污染)l)干燥后向每个管加入μL洗脱缓冲液m)振荡试管直至沉淀物再次重新完全悬浮n)℃温育硅土悬浮液min以洗脱核酸(min后开始振荡试管)o)在,rmin下离心minp)将μL核酸上清液转移至新试管在h内开始扩增反应。以上步骤也可采用Qiagen试剂盒或者其他等同试剂盒进行。核酸扩增a)在向上述μL核酸(p)中加入μL扩增试剂b)℃温育minc)℃温育mind)加入μL酶溶液并用手指轻轻扣击试管促使混合均匀e)放回试管并继续在℃温育minf)将试管稍作离心后在℃温育ming)检测扩增产物h)在℃下保存扩增产物不超过d。核酸检测按照以下步骤或用ELISA进行检测。a)将(N*+)个mL聚丙烯试管进行编号。试管作为空白对照b)振荡混合除了试管外其余试管各加入μL杂交溶液(见附录B)c)试管中加入μL检测稀释液作为空白对照d)其余试管各加µLRNA扩增产物e)封口膜封住所有试管振荡混合f)所有试管℃温育min。每min混合一次g)除了试管外其余试管各加入mL分析缓冲液h)振荡仪器调试参照液直至不透明然后加mLIRS到试管。GBTi)把试管放在转盘式传送盘的适当位置上。j)运行NucliSens阅读器对数据进行分析和解释(见附录C)。*注:N为样品数。结果判定通过大量分析已知阴性对照样品后确定NASBAECL的临界值为X仪器参照溶液的数值。样品的读数超过临界值时判为禽流感病毒阳性低于临界值时判为禽流感病毒阴性。GBT附录A(规范性附录)酶溶液的配制A配制材料a)酶球(enzymesspheres)(单个酶球(mg)含UμLAMV-RTUμLRNaseHUμLTRNA聚合酶,mMTrisHCl,BSA)b)酶球稀释剂(enzymespherediluent)(μgμLBSA)c)球状骨针(reagentsphere)(单个球状骨针为mgmMNTP,mDTT,mMMgCl)。d)球状骨针稀释剂(reagentspherediluent)(mMTrisHClpH,mMdNTP)e)氯化钾溶液(mMKClsolution)f)引物混合物(mMPrimerMixture)g)阳性对照RNA(positivecontrolRNA)h)DEPC水。A配制过程A酶稀释液的制备a)单个球状骨针中加入μL球状骨针稀释剂并迅速振荡均匀b)稀释的球状骨针中加入μLKCl溶液和μLDEPC水振荡均匀c)加入μL引物混合物振荡混合d)不能离心e)在min内使用。A酶溶液的制备a)单个酶球中加入μL酶稀释液将此溶液放置室温至少分钟b)用手指轻轻扣击试管让酶球充分溶解c)不能剧烈振荡任何含酶的溶液d)使用前稍作离心e)在min内使用。GBT附录B(规范性附录)杂交溶液的配制B杂交溶液制备a)振荡通用型捕捉探针和ECL探针直到形成不透明溶液。b)对于N次特异性检测反应在新试管中混合(N+)×μL捕捉探针和(N+)×μLECL探针。c)使用前稍作振荡。d)在min内使用。GBT附录C(资料性附录)NucliSens阅读器的操作运行C建立一个新的运行程序。C打开NucliSens阅读器的个人电脑。C在开始界面点击“Prime”来执行系统校准。C机器准备好后点击“Start”。校准步骤大约持续min。C在登入(login)界面的用户名(username)上选择“serviceengineer”并且点击“login”。不需要输入密码。C在屏幕左上方选择“Routine”菜单然后点击“NewRun”。C在弹出的工作表界面点击“yes”。C输入文件名(不超过个字符)并且点击“ok”。C一个工作表单会打开在分析选择栏(selectedassay)选择“Freetube”。C输入样品号并且点击“Addtolist”。C重复上述步骤直到输入所有样品ID。C输入所有样品号后点击“close”键。C屏幕出现了一张列有所有样品号的工作表。检查工作表检查无误后点击“OK。C确定样品放在转盘式传送盘(instrumentcarousel)上并且按照计算机中输入的样品ID顺序摆放。C在屏幕上方选择“Routine”菜单然后点击“RunWorklist”。C出现一个检查弹出窗口点击“Proceed”。C检测开始(每个试管用时大约min)。C检测停止后在屏幕左上方选择“Routine”菜单然后点击“Sampleresults”或者“Assayresult”显示结果。

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