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扬州大学《植物细胞工程》 第五章 生殖细胞培养(二)

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扬州大学《植物细胞工程》 第五章 生殖细胞培养(二)null第二节 植物胚胎培养第二节 植物胚胎培养植物胚胎培养概念植物胚胎培养概念胚胎培养是将植物的胚胎与母体分离,培养在已知化学成分的培养基获得再生植株的培养过程。 种子的结构种子的结构null植物胚胎培养胚培养(embryo culture) 胚乳培养(endosperm culture) 胚珠培养(ovule culture) 子房培养(ovary culture) 胚胎培养的意义胚胎培养的意义影响植物自然生殖中的几种现象 1、异体或同体花粉在柱头不上萌发 2、正常受精,但形成的胚败育 3、形成...

扬州大学《植物细胞工程》 第五章 生殖细胞培养(二)
null第二节 植物胚胎培养第二节 植物胚胎培养植物胚胎培养概念植物胚胎培养概念胚胎培养是将植物的胚胎与母体分离,培养在已知化学成分的培养基获得再生植株的培养过程。 种子的结构种子的结构null植物胚胎培养胚培养(embryo culture) 胚乳培养(endosperm culture) 胚珠培养(ovule culture) 子房培养(ovary culture) 胚胎培养的意义胚胎培养的意义影响植物自然生殖中的几种现象 1、异体或同体花粉在柱头不上萌发 2、正常受精,但形成的胚败育 3、形成的种子休眠 4、种子生活力低下、萌发率低 一、 胚培养一、 胚培养 无菌条件下将胚从胚珠(幼胚)或种子中(成熟胚)分离出来,置于培养基上进行离体培养获得再生植株的方法。null离体胚培养类型 ⑴成熟胚培养(子叶形成以后) ⑵幼胚培养(子叶形成之前) (一)成熟胚培养 (一)成熟胚培养 成熟胚为子叶期以后的胚,其在简单的培养基上即可萌发生长。对营养条件要求不严格。 主要用来繁殖不易萌发植物,或研究胚和胚乳及子叶的关系等。 null 牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖 Mature embryo culture and rapid propagation of tree peony(二)幼胚培养(二)幼胚培养对发育早期的胚进行培养。1、幼胚培养方法1、幼胚培养方法1、 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 的选择与灭菌:确定授粉后天数与胚胎发育的相应关系,对于远缘杂种胚,要在其夭折前培养。 2、幼胚的分离及培养 分离:先取出胚珠,剥离珠被,取出完整的幼胚,后培养。 培养:胚离体培养发育时期分为异养期和自养期。在心形期转入自养生长。对于难培养的幼胚,可利用胚乳看护培养。 null2、幼胚培养的关键技术: 取材时期--幼胚剥离--培养条件的控制球形胚前期心型胚前期鱼雷胚球形胚null1)培养基 成熟胚是含有根原基和茎原基以及一个或两个子叶。培养时进一步发育产生根和茎,此时在营养上相对独立,只需要提供简单的营养条件,在含有大量元素的无机盐和糖的培养基上即能生长。 幼胚要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成分外,还要加入微量元素和生长辅助物质,不同发育时期的幼胚对培养基成份要求不同,胚龄越小培养及成份越复杂。K+、Ca2+水平稍高有利于幼胚培养2、幼胚培养的关键技术: 取材时期--幼胚剥离--培养条件的控制null2)碳水化合物: 糖的作用: 调节渗透压;碳源;防止幼胚早萌。 渗透压的保持对于幼胚培养相当重要,幼胚需要蔗糖浓度较高。最适蔗糖浓度随着胚的发育时期而降低。 胚发育早期要求较高的的渗透压,而随着胚的发育逐渐降低。胚发育早期要求较高的的渗透压,而随着胚的发育逐渐降低。null3)植物激素的作用: 成熟胚一般不需要外源激素即可萌发。但激素GA能促进休眠胚的萌发。有时GA还具有胚柄的作用. 幼胚需要外源激素,应保持外源激素与内源激素的平衡。过低则不能促进生长,过高则易导致幼胚脱分化形成愈伤。 null4)天然提取物及某些蛋白制品 银杏幼胚培养中添加银杏胚乳有促进作用(1934);曼佗罗幼胚培养中发现添加椰子乳能很好的促进幼胚的发育(200-500um的幼胚) (1941)。 此外,大麦胚乳、麦芽提取物、酵母提取物、水解酪蛋白等都能促进幼胚的发育。null5)环境条件 1)温度: 多数为25-30℃,因植物种类有所差别。 2)光照: 大多数处于球形期至心形期的幼胚,需要在黑暗条件下培养两周后再给予光照,早期光照不利于胚根发育,但胚芽发育需要光照.null3 、幼胚培养中,常见的生长方式 胚性发育(embryonal development)—— 幼胚接种到培养基上以后,仍然按照在活体内的发育方式发育,最后形成成熟胚,然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株,这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。 null早熟萌发(early mature sprouting)—— 幼胚接种后,离体胚不继续胚性生长,而是在培养基上迅速萌发成幼苗,通常称为早熟萌发。 愈伤组织——在许多情况下,幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖,形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织,这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。 在大多数情况下,一个幼胚萌发成一个植株,但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞,以后形成许多胚状体,从而可以形成许多植株,这种现象就是所谓的丛生胚现象。 null二、 植物胚乳培养 二、 植物胚乳培养(一)概念 胚乳培养(Endosperm culture): 是指将胚乳组织从母体上分离出来,通过离体培养,使其发育成完整植株的技术。null(二)概述 胚乳培养的最早研究始于1933年,Lampe和Mills首例进行了玉米胚乳培养。胚乳培养的研究主要集中在以下一些问 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 的探讨: 胚乳细胞的全能性。在离体培养条件下,胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样,具有全能性而再生植株。大多数被子植物的胚乳是三倍体,能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实;通过胚乳培养技术,探索改良农、林及园 艺植物三倍体育种技术的可能性。nullnull研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。 到目前为止,已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、叶等或得到愈伤组织。 null(三)植物胚乳的发育特性: 植物胚乳可以分为两大类:被子植物胚乳和裸子植物胚乳。被子植物胚乳是双受精的产物,它由二个极核和一个雄配子融合形成,所以,在染色体倍性上它属于三倍体组织。裸子植物很特殊,它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为配子体的一部分,由大孢子直接分裂发育而成,因此它是单倍体组织。null胚乳按发育初期是否形成细胞壁可分为三种类型:核型胚乳 胚乳最初发育经过一段游离核阶段,绝大多数被子植物的胚乳属于核型胚乳。游离核阶段时间长短因植物不同而异。 nullnull 细胞型胚乳 和核型胚乳不同,细胞型胚乳的发育不经过游离核阶段而按正常的细胞分裂方式进行。胚乳初生核第一次分裂后即形成两个子细胞,以后每次分裂都形成细胞壁。某些合瓣花植物,如烟草、芝麻、以及番茄等是属于此类。 nullnull沼生目型胚乳 沼生目型胚乳是核型与细胞型之间的中间型。初生胚乳核第一次分裂为细胞型,以后两个细胞中的核进行游离核分裂。单子叶植物的某些类群。 null(四)胚乳培养过程(四)胚乳培养过程1、胚乳外植体的制备 ⑴胚乳较大块组织的种子,可直接将种子 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面灭菌,无菌条件下除去种子的外皮即可培养。 ⑵桑寄生类植物,胚乳被流质层包裹,不好取出胚乳,可先将种子表面灭菌,无菌条件下剥开种皮,去掉粘性流质层,取出胚乳。 (四)胚乳培养过程(四)胚乳培养过程2、接种培养 取授粉几天后的幼果,表面灭菌后,无菌条件下切开幼果,取出种子,小心分离出胚乳,接种在培养基上。 培养室温度25-27℃,黑暗或弱光下(四)胚乳培养过程(四)胚乳培养过程3、离体胚乳的发育及其植株的形成 ⑴愈伤组织的诱导 胚乳接种后的6-10天后,不断增生成乳白色团状,成为愈伤组织。少数胚乳外植体可转为绿色叶状丛。 ⑵愈伤组织的再分化 生长旺盛的愈伤组织应及时进行分化培养,此时需光。 ⑶胚乳苗的生根培养 转入生根培养基10-15天后即可长根null(五)影响胚乳培养的因素 基因型; 胚乳的发育时期; 培养条件;nullA、胚乳发育时期的影响 发育早期胚乳:操作不便,诱导率低 游离核期或刚转入细胞期的核型胚乳:难获得愈伤 旺盛生长期胚乳:易诱导产生callus 成熟期胚乳:已高度分化,很获诱导脱分化null★ 旺盛期胚乳特征 §胚已分化完成 §胚乳已形成细胞组织 §充分生长,达到成熟大小 §外观为半透明的固体状 §富有弹性null水稻:授粉后4 d 黑麦草:授粉后8-10 d 黄瓜:授粉后7-16 d 梨:授粉后20 d 大麦:授粉后10-20 d 玉米和小麦:授粉后8 -12 d一些草本植物胚乳培养的适宜取材时期nullB、培养基和激素的影响 基本培养基:MS、B5、MT、White、LS等 水解酪蛋白、酵母提取物也很必要 激素:要求特殊 大麦胚乳只有在添加2,4-D的培养基上才能生长 猕猴桃胚乳培养中,玉米素最好 枣的胚乳培养中,激素似乎无特殊要求nullC、胚因子 胚在萌发时产生某种物质影响胚乳的发育过程,这种胚对胚乳的影响,即称为“胚因子”影响。 胚乳培养中,外源GA3能部分取代胚因子。 nullD、其他因素的影响 蔗糖浓度:3%-5% 温度:25℃ pH值:如 蓖5.0; 玉米 6.1-7.0;苹果 6.0-6.2等 null※枸杞胚乳培养的过程 开花20d的枸杞胚乳 MS + 2,4-D 0.2mg/L 生根 MS 分化出苗 MS + BA 0.2mg/L 不同倍性的胚乳植株callus胚乳培养的形态发生 器官发生; 愈伤组织形成。 (六)胚乳培养植株要进行染色体倍性检测(六)胚乳培养植株要进行染色体倍性检测(1)因为在胚乳培养中,由于愈伤组织的倍性比较复杂,有二倍体、三倍体等多种倍性以及非整倍体,真正的三倍体细胞所占的比例甚小。 (2)诱导分化的胚乳植株中染色体数也不稳定,同一植株往往有可能是不同倍性的嵌合体。null再生植株的染色体倍数 1、稳定型 继代培养后染色体无变化,植株三倍体 2、畸变型 细胞染色体异常,植株为多倍体,且不一致,形成多种倍性细胞组成的嵌合体。 三、胚珠培养三、胚珠培养 在人工控制的条件下,对胚珠进行离体培养使其生长发育形成植株的技术。 1942首次在兰花中尝试成功,缩短了从授粉到种子成熟的时间。1980年成功培养了未授粉的非洲菊、烟草的胚珠,获得了单倍体植株null 由于幼胚分离难度大,而胚珠分离则相对容易,在幼胚培养时常采用胚珠培养。 分为两种类型:受精胚珠培养 未受精胚珠培养null 植物胚珠结构图示null(一)胚珠培养的意义: 防止杂种胚早期败育,获得杂种植株; 受精前胚珠培养,可作为试管受精的基础; 未受精胚珠培养,能培养获得单倍体植株,用于单倍体育种。null(二)胚珠培养方法: 1、材料的选择和灭菌: 未授粉胚珠:开花前1-6天, 授粉胚珠:授粉后1-120天不等,较晚时期有利于胚的发育。 灭菌:先对子房或外表组织消毒灭菌后,后取出胚珠培养。 null 2、培养基的影响: 植物激素:细胞分裂素对授粉胚珠发育常有促进作用。 有机物:添加有机附加物可以促进授粉胚珠的发育。 蔗糖浓度:3-12%,通常5%,高浓度利于孤雌生殖。null 3、胎座和子房对胚珠培养的影响:带有胎座或子房组织的胚珠相对较易培养。 4、胚发育时期的影响:一般来说,合子或早期原胚期的胚珠较难剖取和培养,对培养基的成分要求也较严格。null四、 子房培养子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。 1942年,La Rue首先对番茄、落地生根属(Kalanchoe)、连翅属(Forsythia)和驴蹄草属(Caltha)授粉的花连带一段花梗进行了培养,在无机盐培养基上得到了正常的果实。 null 1949年和1951年Nitsch建立了较完整的子房培养技术,他培养了小黄瓜、番茄、菜豆、草莓和烟草等植物授粉前和授粉后的子房,在含蔗糖的无机盐培养基上,授粉后的小黄瓜和番茄获得了成熟果实及具有生活力的种子。 1969年Nitsch等在水稻上进行了未授粉子房培养的尝试,并得到了植株,但这些植株是属于二倍体和四倍体的。 null 1971年Uchimiya等从未授粉玉米子房培养中获得了愈伤组织和分化的不定根,但也不是单倍体的。 1976年San Noeum在未授粉的大麦子房培养中首次获得了单倍体植株。以后,相继在大麦、烟草、小麦、向日葵、水稻、玉米、百合、青稞、荞麦、白魔芋、杨树等数十种植物上获得了单倍体植株。null材料的选择: 品种间的差异; 胚囊发育时期 子房培养是否成功,除选择适宜的基因型外,其胚囊所处的发育时期对胚状体的诱导频率起关键作用。null 植物激素的影响: 百合未授粉子房培养, 2,4 - D单独使用诱导频率为18.87%; 2,4 - D+6-BA 诱导频率为33.73%; 2,4 - D+KT 诱导频率为47.76% .蔗糖浓度: 蔗糖浓度多在3~10%之间,因不同植物材料而异,一般是诱导培养阶段蔗糖浓度要高一些,分化培养时蔗糖浓度要低一些。 null未授粉子房培养应注意的问题: 1、材料的选择:发育时期(接近成熟胚囊易于成功) 2、培养基:基本培养基(MS、N6、B5等)、植物激素(配合使用)、蔗糖浓度(3-10%) 3、培养方式:直插优于平放。单倍体胚有多种,可以是卵细胞、助细胞或反足细胞等。nullMuch of our current understanding about the role of phytohormones in fiber growth and development comes from studies of isolated ovules in culture. Fiber initiation in unfertilized ovules is promoted by the addition of auxin and gibberellic acid. 五、离体受精五、离体受精(一)概念 又称试管受精,指在离体环境中完成被子植物的受精过程,并利用所产生的“离体合子”培养再生植株的过程. 离体受精包括配子分离、雌雄配子融合、人工合子培养三个过程(二)离体受精的技术基础(二)离体受精的技术基础1.配子分离 1) 卵细胞的分离 酶学的方法 直接解剖法 2) 精细胞的分离 渗透压冲击法 机械分离法 离体受精技术突破的技术前提: a、雌配子和雄配子分离技术 b、单对原生质体融合技术 c、微培养技术 null2. 单对配子融合 微电融合 85%融合率,只有此法融合的产物再生了植株。 高钙—低pH介导融合 电融合方法的代替技术。 一般钙条件融合 PEG诱导的融合 null 3. 人工合子的培养 培养方法——目前常采用微室饲养培养 将商品生产的微室置入饲养细胞的小培养皿中,培养物接微室内,通过室底部微孔滤膜吸取周围饲养细胞(feeder cells)释放的活性物质,促进其发育。 nullFeeder Cell: 未成熟胚悬浮细胞或小孢子细胞 Feeder Cell促进被饲养物生长的原因: 1)增加细胞密度 2)细胞旺盛分裂或分化过程中产生活性物质 ——生长促进因子(GPF) (维持细胞分裂、生长和发育所必需的) 从离体受精到植株开花约需100天,形成的籽粒具有正常发育的胚和胚乳。 离体融合产生的合子培养获得再生可育植株是在玉米中实现的。 从离体受精到植株开花约需100天,形成的籽粒具有正常发育的胚和胚乳。 离体融合产生的合子培养获得再生可育植株是在玉米中实现的。 null(三)离体受精的研究意义(三)离体受精的研究意义 1.用于遗传育种中可以克服自交不亲和性,进行作物改良。 2. 为受精生物学的重要理论问题的探索与解决开辟了新的途径;离体受精的细胞学研究现状离体受精的细胞学研究现状1. 配子识别——判别糖蛋白的作用 利用分离的雌、雄配子对其细胞膜特征,如表面膜蛋白 特别是糖蛋白的分布等直接进行分析,这可以帮助判断 糖蛋白在被子植物中是否和在动物及低等植物中一样是 配子识别必不可少的; 2. 膜融合——多精入卵问题的探讨 3. 胞质融合——精细胞质全部进入卵细胞 4. 核融合——融合过程中的信号问题 离体受精的细胞学研究现状离体受精的细胞学研究现状1. 配子识别——判别糖蛋白的作用 2. 膜融合——多精入卵问题的探讨 膜融合的方式,在不同的离体受精系统中融合的原理是 不同的,一种是精细胞质很快进入卵细胞,精细胞膜作 为其中的一部分参与了受精卵细胞膜的重组。另一种是 精细胞整体进入卵细胞,精细胞膜并不参与融合产物细 胞膜的形成。 3. 胞质融合——精细胞质全部进入卵细胞 4. 核融合——融合过程中的信号问题 离体受精的细胞学研究现状离体受精的细胞学研究现状1. 配子识别——判别糖蛋白的作用 2. 膜融合——多精入卵问题的探讨 3. 胞质融合——精细胞质全部进入卵细胞 体内自然受精过程中,至少部分被子植物的精细胞质未 能进入卵细胞;而在离体受精时,精细胞质则全部进入 卵细胞 。 4. 核融合——融合过程中的信号问题 离体受精的细胞学研究现状 离体受精的细胞学研究现状1. 配子识别——判别糖蛋白的作用 2. 膜融合——多精入卵问题的探讨 3. 胞质融合——精细胞质全部进入卵细胞 4. 核融合——融合过程中的信号问题 核融合一般在精—卵融合后35-90min出现 。烟草卵细胞 有明显的极性即液泡端和胞质端,但无论精子在卵细胞 哪一端融合,卵细胞质都可很快地移向精核处将其纳入 并包被。 IVF的研究意义IVF的研究意义 1. 为受精生物学的重要理论问题的探索与解决开辟了新的途径; 2. 用于遗传育种中可以克服自交不亲和性,进行作物改良。 离体受精所能克服的是那些以花粉—柱头或花粉—花柱相互作用为基础的不亲和障碍,并不是万能的。 当前热点问题 当前热点问题 利用离体受精系统研究受精与早期胚胎发生过程中的基因表达,是本领域研究由细胞水平进入分子水平的新趋势,主要工作是 1. 构建DNA文库研究基因表达; 2. 利用显微注射技术(Microinjection)来将外源基因导入卵和合子的实验。
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