慢病毒与逆转录病毒

亲嗜性逆转录病毒 慢病毒 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 　　目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 　　慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 　　慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 　　这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 　　● 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 　　● 进行稳转细胞株的筛选； 　　● 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 　　在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 　　实验流程如下： 　1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体； 　2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 　3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T 细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液； 　4. 浓缩、纯化病毒液； 　5. 用高质量的病毒液感染细胞； 　6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果； 　7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 逆转录病毒 【什么是逆转录病毒】 　　逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，新合成的cDNA插入宿主的核DNA中，随宿主DNA复制、转录、翻译达到扩增目的的一类病毒。逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（vonc），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 构建成一些缺陷型病毒（defective virus）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的DNA顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（helper virus）。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的RNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒RNA，进入骨髓细胞，病毒DNA插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷”在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。 　　1970年科学家在致癌RNA病毒中发现一种特殊的RNA病毒聚合酶，该酶能以RNA为模板，根据碱基互补原则，合成cDNA。这一过程与一般病毒转录方向相反，故称逆转录，催化此过程的酶称为逆转录酶,后来发现在哺乳动物的胚胎细胞和正分裂的淋巴细胞也含有。 　　逆转录病毒又称为携带逆转录酶的病毒，它先侵入宿主细胞以病毒RNA为模板，靠酶形成DNA环化，然后合到宿主细胞的染色体中去以原病毒形式在宿主细胞中一代代传下去。 　　【逆转录病毒分类】逆转录 　　分为三类： 　　致瘤病毒 　　可以导致癌症如白血病等。它们含有癌基因（oncogene）。目前已发现35种致癌病毒,能在禽类与老鼠身上造成恶性疾病,在人类目前只有第一型人类T细胞白血病病毒(HTLV-1),能造成成人急性T细胞淋巴性白血病(ATLL),此病毒可经由输血,性行为,或哺乳传染,在日本南部为地区性流行.每20名感染者中约有一名会发病,平均在感染後30-50年间.ATLL的表现除了白血球增加外,皮肤表现亦为特徵.其细胞具有多型性且多叶的细胞核,有花细胞之称. 慢病毒 可以导致慢性病如艾滋病等 泡沫病毒 不导致疾病 由于逆转录过程比较不稳定，因此逆转录病毒的变异过程比较快。这使研究针对逆转录病毒的免疫抗体的过程非常困难。 　　大多数针对逆转录病毒的治疗方法（比如目前拥有的针对艾滋病的药物）主要是针对病毒的逆转录过程。但由于病毒迅速的变异过程病毒往往会很快就产生对药物的阻抗。 　　按照目前国际病毒分类标准，逆转录病毒科分为7个属： 　　α逆转录病毒属 Alpharetrovirus 　　β逆转录病毒属 Betaretrovirus 　　γ反转录病毒属 Gammaretrovirus 　　δ反转录病毒属 Deltaretrovirus 　　ε反转录病毒属 Epsilonretrovirus 　　慢病毒属 Lentivirus 　　泡沫病毒属 Spumavirus 　　其中的慢病毒属又分为5个组，包括牛慢病毒组、马慢病毒组、猫慢病毒组、羊慢病毒组和人类慢病毒组。HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。根据生物学的分类，逆转录病毒可以分为7个属，在这些病毒当中我们最熟悉的是人类免疫综合症（HIV）。HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。 　　【逆转录病毒和基因治疗】 　　从1990年美国施行第一例基因治疗计划到目前为止，全世界共有几百例临床计划在实施中。当初人们对基因治疗普遍寄予厚望，但结果却往往不尽如人意。人们意识到在基因组、基因的表达调控及疾病发生的机理没有彻底阐明之前，基因治疗还很难取得突破性进展。但基因治疗的出现，毕竟给我们治疗一些用传统疗法难以治愈的疾病带来了新的希望。 　　逆转录病毒载体 　　逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的上佳选择。最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。而另一类整合载体-腺相关病毒，以同源重组的方式整合，整合过程中病毒基因组发生重排，可能会影响到外源基因的结构与功能 　　如果能实现有效的基因转移，基因治疗在对付遗传性疾病、减缓肿瘤发展、战胜病毒性感染和终止神经系统退行性病变等方面都会有广阔的应用前景。这就要求在载体改造、载体的靶向性、外源基因的表达调控等诸多方面取得显著进展。基因转移载体可分两大类：病毒性载体和非病毒性载体。非病毒性载体的方法包括裸DNA注射、基因枪法、多聚赖氨酸或阳离子脂质体包裹DNA法等。一般非病毒性载体毒性成分少，且较安全。但它们存在共同的弱点：效率低且携带基因表达时间短。所以目前研究仍是一些病毒性载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等。逆转录病毒应用最早，研究也相当成熟，目前仍被广泛应用。慢病毒也是一类逆转录病毒，它表现出的一些特点使人们对其逐渐产生了兴趣。逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的上佳选择。最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。而另一类整合载体——腺相关病毒，以同源重组的方式整合，整合过程中病毒基因组发生重排，可能会影响到外源基因的结构与功能。 　　逆转录病毒的靶向性 　　逆转录病毒可以与多种细胞表面蛋白结合而进入细胞，其宿主细胞范围很广。逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异，据此可将其分为三类：(1)单嗜性逆转录病毒(ectropic retrovirus)，只感染小鼠和少数几个品种的大鼠；(2)兼嗜性逆转录病毒(amphotropic retrovius)，能感染小鼠的细胞，也能感染其他种属动物的细胞；(3)异嗜性逆转录病毒(xenotropic retrovirus)，能感染多种动物细胞，但不能感染小鼠细胞。目前使用较多的是兼嗜性逆转录病毒，即以兼嗜性包装细胞包装病毒颗粒。逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白(Env)决定，病毒基因组不影响其靶向性，不同的基因组可用相同的Env包被，且Env来自何种病毒，包装出的病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。 　　通过改变Env蛋白可以改变载体的靶向性。如用水泡性口炎病毒的G蛋白包装逆转录病毒基因组产生假病毒(pseudotype)，可拓展逆转录病毒的靶细胞范围并赋予病毒颗粒新的特性。兼嗜性逆转录病毒一般结合细胞表面的磷酸转运体而进入细胞，但有一些重要的靶细胞：淋巴细胞、早期造血干细胞磷酸转运体的表达水平很低，而导致载体对其转导效率低下。G蛋白包装的假病毒则得有效感染这些细胞。这种假病毒还可以用超速离心进行浓缩达到很高的滴度(109 cfu/ml)，普通的逆转录病毒只能达到106 cfu/ml；G蛋白还能抵抗人类补体的灭活作用，使其适于作体内(in vivo)的基因转移。 　　为提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，还可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(scFv)。如Martin等设计的特异靶向黑色素瘤细胞的逆转录病毒。他们在病毒包被糖蛋白的表面结构域(SU)上依次接上间质金属蛋白酶的酶切位点、一段富含脯氨酸的肽段及一段特异识别高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)的SCFU。90%的人黑色素瘤细胞高水平表达HMW-MAA这一穿膜分子，而绝大多数成人组织不表达。富含脯氨酸的肽段则暂时阻端SU和磷酸转运体的结合。肿瘤细胞表面还有高表达的间质金属蛋白酶，它在肿瘤细胞对正常组织的侵入中发挥重要作用。这样改造过的载体在SCFV的导向下达到肿瘤部位，肿瘤细胞表面的金属蛋白酸切去SU上的SCFV和脯氨酸肽段，SU和肿瘤细胞表面的磷酸转运体结合，进入肿瘤细胞，从而大大提高了载体靶向的特异性。 　　逆转录病毒载体感染非分裂细胞的探索 　　具有感染终末分化细胞的能力，高的转导效率和持续且可控制的基因表达是理想的基因治疗载体的三大特点。逆转录病毒虽具有后面两个优点，但不能感染非分裂细胞如肌肉、大脑、肺及肝组织中的这些可以做为基因治疗靶细胞的重要细胞。由于逆转录病毒的复制特点，它感染细胞时，细胞分裂需处于DNA合成阶段。因此有人尝试使用组织损伤或部分切除来诱导靶细胞分裂。例如肝脏部分切除可以极大地提高逆转录病毒在肝内的转导效率。 　　还有一种途径是利用一些基因的产物来诱导间歇期细胞进行DNA复制来增强逆转录病毒的感染。SV40的大T抗原可以诱导终末分化的肌肉细胞进行DNA复制和细胞分裂。表达温度敏感的大T抗原的肝细胞可被逆转录病毒高效感染。用巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)预先刺激间歇期细胞也可以大大增强逆转录病毒载体的感染效率。 　　逆转录病毒载体表达的调控 　　有人用ex vivo的方法，在肌细胞中表达IX因子，治疗小鼠血友病B。发现感染细胞回输小鼠后5～7d，IX因子的表达即被“关闭”了。证明不是由于细胞丢失、基因删除或免疫 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 的原因。而可能是由于持续表达的外源基因诱导机体对其进行修饰而失去表达，因此要求基因在诱导物的作用下短暂表达，目前使用较多的有四环素诱导调控系统和雌激素诱导调控系统等。除此之外增强与启动子的正确组合也能避免基因表达被关闭。仍以上例，若用ATP肌酸磷酸转移酶的增强子——启动子来控制外源基因表达，只能得到低水平的表达，换用ATP肌酸磷酸转移酶增强子——巨细胞病毒启动子的嵌合载体，外源基因的表达可以持续两年。寻找载体调控元件的合理组合需长期摸索，在多基因载体中这种任务显得更加艰巨。