固相萃取技术原理与应用[1]

中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 固相萃取技术原理及应用 ——中国色谱网在线技术讲座 活动主办方：中国色谱网（www.sepu.net） 活动协办方：天津博纳艾杰尔科技公司（活动独家赞助商） 主讲人： echo_zhang（博纳艾杰尔技术工程师） 主讲内容： 第一部分 固相萃取基本原理与操作………………………P1-3 ·固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理………P1 · pH 值对固相萃取的影响………………………………P1 ·固相萃取操作步骤及注意事项…………………………P1 第二部分 固相萃取方法的建立与优化……………………P3-10 ·初步固相萃取方法的建立………………………………P4 ·固相萃取柱的选择………………………………………P4 ·选择合适的固相萃取方法………………………………P5 ·固相萃取方法的优化……………………………………P7 第三部分 固相技术应用实例解析………………………P10-22 ·固相萃取技术在食品分析方面的应用实例解析………P10 ·固相萃取技术在环境领域中的应用实例解析…………P15 ·固相萃取技术在药物分析中的应用实例解析…………P19 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 一、固相萃取基本原理与操作 1111、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理 固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留 /吸附的 1）疏水作用力：如 C18、C8、Silica、苯基柱等 2）离子交换作用：SAX, SCX，COOH、NH2 等 3）物理吸附：Florsil、 Alumina 等 2222、pppp HHHH 值对固相萃取的影响 pH 值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。对于强阳/阴离子交换柱来讲，因 为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附 保留。而目标物的离子化程度则与 pH值有关。如对于弱碱性化合物来讲，其 pH 值必须小 于其 pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其 pH 值必须大 于其 pKa 值两个单位才能保证其完全离子化。对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸 附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的 pH 值必须满足一定的条件才能保证其 完全离子化。 3333、固相萃取操作步骤及注意事项 针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同。 1）填料保留目标化合物 固相萃取操作一般有四步（见图 1）： � 活化---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要使小柱干涸） � 上样---- 将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。（注意流速不要过 快，以 1ml/min 为宜，最大不超过 5ml/min） � 淋洗---- 最大程度除去干扰物。（建议此过程结束后把小柱完全抽干） � 洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。（注意流速不要过快，以 1ml/min 为宜） 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 分析物 干扰物 柱预处理 样品添加 柱洗涤 分析物洗脱 图 1 固相萃取操作步骤（填料保留目标化合物） 2）填料保留杂质 固相萃取操作一般有三步（见图 2）： � 活化--除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不 要使小柱干涸） � 上样--将样品转移入柱，此时大部分目标化合物会随样品基液流出， 杂质被保留在柱上，故此步骤要开始收集（注意流速不要过快） � 洗脱---用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集，合并收集液。（注意 流速不要过快） 此种情况多用于食品或农残分析中去除色素。 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 图 2 固相萃取操作步骤（填料保留杂质） 二、固相萃取方法的建立与优化 固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单，但建立一个固相萃取的方法并无快捷方式 可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素，归纳起来可通过下图来了解： ①评估萃取中的问题 评估分析的要求 样品的特性 浓缩的要求 样品需要如何稀释 检测方法的灵敏度如何 分析物 分子量、功能团、极性、溶解度、pKa 纯度的要求 检测方法的特殊性 有哪些可能的干扰 样品基液 从原样品溶液中萃取（如环境水样） 从固态样品释放分析物（匀浆、超声 波、消化） 溶剂的限制 检测方法所接受的水溶性洗脱液需 要的有机洗脱液 干扰物 分子量、功能团、极性、溶解度、pKa ②建立初步的方法 选择萃取方法 选择萃取 SPE材料 选择洗脱溶剂 选择取样质量/体积 选择样品基体处理方法 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 1111、初步固相萃取方法的建立 建立初步的萃取方法要考虑： ·选择合适的 SPE 柱 ·选择合适的固相萃取方法 ·方法的优化 2222、固相萃取柱的选择 1111）柱填料的选择 首选根据目标化合物与干扰物的差异，如极性，分子量，pka 值等，选择合适的填料。 2222）固相萃取柱规格的选择 对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说，被萃取样品的质量不超 SPE 柱填料的 5%（参 考值，同一种 SPE 柱对不同的目标物选择性不同，吸附容量不同）； 离子交换型的固相萃取柱，必须考虑离子交换的容量。不同厂家的小柱离子交换容量稍有差 异。下表附 SPE 小柱的容量和洗脱参数 ③优化 SPE方法 用标准溶液过 SPE 柱考察分析物被洗脱的情况 好 用没有基液的标准溶液对分析物进行萃取 好 检验从基液中萃取分析物的情况 好 检测干扰物是否与分析物同时被洗脱 好 确认方法 重新评估问题 不好 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 SPESPESPESPE柱上样容量和洗脱体积的选择 规格 最大上样量 最小洗脱体积 100mg/1mL 5mg 250µL 200mg/3mL 10mg 500µL 500mg/6mL 25mg 1.2mL 1g/6mL 50mg 2.4mL 3333、选择合适的固相萃取方法 固相萃取的保留机制可分为两种： ·吸附剂（填料）保留目标化合物：绝大多数化合物应用此机制，填料保留其目标组分及少 量杂质，通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质，最后选择合适的（洗脱）溶剂把目标组 分洗脱下来。 根据吸附剂的保留机理可进一步分为： （1111）反相（C18,C8,CN,C18,C8,CN,C18,C8,CN,C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1Phenyl,C4,C1Phenyl,C4,C1Phenyl,C4,C1） � 分析物：非极性至中等极性 � 基质：水溶性 � 方法： a.活化：通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化，然后用水平衡 b.淋洗：含 0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质 c.洗脱：极性或非极性溶剂洗脱目标物 （2222）正相（Silica,Silica,Silica,Silica, Florisil,Diol,NHFlorisil,Diol,NHFlorisil,Diol,NHFlorisil,Diol,NH2222） � 分析物：中等极性到强极性 � 基质：非极性至中等极性 � 方法： aaaa....活化：非极性有机溶剂 bbbb....洗脱：非极性有机溶剂 反相溶剂洗脱强度 己烷 异辛烷 四氯甲烷 氯仿 二氯甲烷 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 四氢呋喃 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 乙腈 异丙醇 甲醇 水 正相溶剂洗脱强度 （3333）阳离子交换（SCX,PRS,COOHSCX,PRS,COOHSCX,PRS,COOHSCX,PRS,COOH） � 分析物：阳离子（碱性）化合物 � 方法： 1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的 样品时，可用水溶性有机溶剂过柱后，然后用水平衡，最后再用适当 pH 值的缓冲溶液 进行平衡。 2.上样：样品溶液 pH 值要小于其 pKa 两个单位（以保证其带电荷 ） 3.洗脱：洗脱溶液 pH 值要大于其 pKa 两个单位（中和分析物的电荷） （4444）阴离子交换（SAX,PSA,NH2SAX,PSA,NH2SAX,PSA,NH2SAX,PSA,NH2，PAX/MAXPAX/MAXPAX/MAXPAX/MAX ） � 分析物：阴离子（酸性）化合物 � 方法： 1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的 样品时，可用水溶性有机溶剂活化后，然后用水平衡，最后再用适当 pH 值的缓冲溶液 进行平衡。 2.上样：样品溶液 pH 值要大于其 pKa 两个单位（以保证其带电荷 ）。 3.洗脱：洗脱溶液 pH 值要小于其 pKa 两个单位（中和分析物的电荷）。 � 吸附剂（填料）保留杂质： 食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分， 所以上样后即开始收集目标组分，最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。 （1）活化：以样品所在的有机溶剂进化活化，1-2 柱管体积 （2）上样：提取液转移至柱内，并收集流出液 （3）洗脱：用样品所在的有机溶剂进一步洗脱，收集流出液。合并上样和洗脱流出液。 4444、固相萃取方法的优化 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 1111）影响萃取效率的因素 （1111）填料（固定相）-------------------- 核心 选择合适的 SPE 柱是保证理想结果的前提。 （2222）洗脱溶剂的强度： � 采用正相固定相时，溶剂强度随其极性增强而增加； � 采用反相固定相时，溶剂强度随极性减弱而增强。 （3333）pHpHpHpH值： 离子交换固定相、被分析物和干扰物质的 pKa 各不相同。通过调节 pH 大小，可以使 固定相带电荷，被分析物带相反电荷，而使干扰物质不带电荷；或者反过来，使固定相带电 荷，干扰物质带相反电荷，而使被分析物不带电荷。 （4444）操作：控制合适的流速、活化的时不要让柱干涸等 2222）常见问题及解决方法 ·分析物回收率低 ·萃取重现性差 ·洗脱馏分中含有干扰物 ·SPE 柱流速降低或阻塞 具体解决方案如下： A. 分析物回收率低 • 未保留？ • 被淋洗？ • 未被洗脱或部分洗脱？ 首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集，进样分析，确定问题来源 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 分析物没有或 部分被吸附 分析物未被洗 脱 SPE柱选择不合适 SPE柱没有很好地被 预处理 竞争吸附 选择对分析物有明显选择性 的SPE柱 反相柱用甲醇，或乙腈处理 小柱，后以水溶液平衡 降低有机溶剂的含量或改变 样品溶液的pH值 洗脱溶剂强度不够 洗脱溶剂体积太小 填料-分析物作用力太 强 调节洗脱溶剂极性或pH值 增加洗脱溶剂体积 改变填料，如反相柱：选择 疏水性弱的填料；阳离子交 换：用COOH代替等 B.B.B.B. 重现性差 样品添加前，SPE柱已干 SPE柱负载 洗脱液流速过快 重新活化SPE柱 减少样品量（<柱填料的5%）或选 降低流速,控制在1mL/min以内， SPE用极性溶剂淋洗，而洗 脱溶剂是不兼容的非极性 溶剂 分析物在淋洗时被洗掉 分析物在样品溶液中溶解 度过大 在使用非极性溶剂之前对SPE柱 进行干燥 降低淋洗液的强度 降低样品溶液极性，含量或pH值 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 C.C.C.C. 洗脱馏分中含有干扰物 干扰物与分析物同时被洗 脱 1） 在洗脱分析物之前选用中等极性的溶剂将干 扰物洗涤出SPE柱 2）选用对分析物亲合力更大而对干扰物亲合力 低的SPE柱 干扰物来自SPESPESPESPE柱 在柱子预处理之前用洗脱溶剂洗涤SPE柱 D.D.D.D. SPESPESPESPE柱流速降低或阻塞 样品存在过多的颗粒 样品溶液粘度太大 用溶剂对样品进行稀释. 对样品进行过滤或离心 举例说明 1.1.1.1. 参考文献方法用 C18 柱做相关药物的净化，过柱方法如下：分别用乙酸乙酯、甲醇和水 活化小柱，然后把处理过的样品过柱（溶剂为具一定 pH 值得缓冲溶液），水淋洗小柱后， 用乙酸乙酯洗脱目标物。 结果：接受液混浊状，回收率和重现性都不理想，可能是什么原因呢？ 答案：正确的做法是要在淋洗过程结束后把小柱完全抽干。原因有二，其一因为淋洗溶 剂（水）与洗脱溶剂（乙酸乙酯）不互溶，如果不抽干洗脱溶剂与目标物不能充分作用， 所以造成回收率和重现性都没有保证，同时从外观上看 接受液是液混浊液；其二如果 淋洗过程不抽干小柱，洗脱溶剂里会引入水（淋洗剂），对下一步浓缩造成很大的困难。 2.2.2.2. 水中的灭草松前处理方法 pka=3.3 取 500ml 水样过滤，待过 Cleanert PEP柱（相当于 Waters HLB）净化 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 1）用 5mL 四氢呋喃洗柱子，除掉杂质 2）用 5mL 甲醇 1mL/min 活化柱子 3）用 5mL 纯水 1mL/min 活化柱 4） 500mL 的水样以 5mL/min 的速度过柱 5） 5mL 纯水 2mL/min 淋洗 6）小柱真空抽干 20min 7） 0.9mL 的甲醇 1mL/min 淋洗，弃去淋洗液 8） 3mL 四氢呋喃 1mL/min 的速度洗脱柱子，收集洗脱液浓缩定容至 3mL 液相检测。 结果：回收率不理想，请问此方法有何问题？ 答案：因为目标物灭草松呈酸性， pKa=3.3pKa=3.3pKa=3.3pKa=3.3，而选择的小柱 PEPPEPPEPPEP 是极性的。所以正 确的做法是样品在过柱之前一定要调节水样的 ppppHHHH 值 小于等于 3333，使目标物分子化， 以保证目标物能被小柱充分保留，否则在上柱的过程中容易造成“漏”的现象，从 而造成回收率差。 三、固相技术应用实例解析 1111、食品领域应用 1111）动物组织中盐酸克仑特罗等 4444种β----激动剂药物残留检测（CleanertCleanertCleanertCleanert PCXPCXPCXPCX,,,, P/N:P/N:P/N:P/N: CX1506CX1506CX1506CX1506） 1.1.1.1.实验材料 1.1 固相萃取小柱：PCX(150mg/6mL) 1.2 四种β-激动剂药物：盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等 4 种β-激动 剂药物。 2.2.2.2. 试样的制备 取猪肝空白样品，经过液液萃取初步处理后，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试 样。 3.3.3.3. 净化 依次用甲醇 5mL、水 5mL 和 30mmol/L 盐酸 5mL 润洗固相萃取小柱，将上述备用液过 柱，依次用水 5mL、甲醇 5mL 淋洗，真空抽干，用 4%氨化甲醇 5mL 洗脱 PCX 小柱，收 集洗脱液于具塞玻璃试管中，50℃下氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在 1mL/min 左右。 4.4.4.4. 衍生化及检测 将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入 50℃烘箱中加热片刻，除去水分后，加入甲苯 100µL 和双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）100µL，涡旋振荡 20s，密封玻璃塞，置于 80℃恒温烘箱中加热 1 小时，冷却后加入 300µL 甲苯，作为试样溶液，供气相色谱-质谱分 析（色谱柱：DA-5MS, 30m×0.25mm×0.25µm，P/N:1525-3002）。 5.5.5.5. 结果 5.1 回收率实验（精密度和准确度） 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后，分别添加一定量的标准溶液，配制 1μg/L、 2μg/L、5μg/L、10μg/L 和 100μg/L 五个浓度的试样溶液，每批次内同一浓度做 5 次平行实 验，共 4 个批次（样品典型回收率色谱图见附图）。 猪肝中实验结果列表如下 添加浓度 （μg/L） 回收浓度 （μg/L） 平均回收值 （μg/L） 平均回收率 （%） 相对标准偏差 （%） 1 0.75 0.72 72.40 5.93 0.67 0.72 0.70 0.78 2 1.62 1.63 81.30 1.23 1.66 1.60 1.61 1.64 5 4.02 4.24 84.80 4.16 4.10 4.27 4.38 4.43 10 8.24 8.45 84.45 2.81 8.35 8.77 8.62 8.25 100 90.24 9.12 91.15 2.86 87.15 91.77 92.62 93.95 5.2 重复性实验（批间误差实验）： 猪肝中实验结果列表如下 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 批间 添加浓度（μg/L） 1 2 5 10 100 平均 回收率 % RSD % 平均 回收 率% RSD % 平均 回收 率% RSD % 平均 回收率 % RSD % 平均 回收率 % RSD% 1 72.40 5.93 81.3 0 3.49 84.8 0 6.16 84.45 3.59 91.15 2.86 2 75.37 6.12 80.4 7 5.37 84.7 4 7.55 87.46 4.68 90.05 3.86 3 70.09 7.85 80.8 0 6.57 83.1 0 8.17 83.21 5.39 89.53 4.16 4 76.73 4.90 78.5 0 8.35 82.9 0 5.11 85.95 5.72 88.27 5.93 平均 值 73.65 6.20 80.2 5 5.95 83.8 8 6.75 85.27 4.84 89.75 4.20 RSD % 12.95 10.79 9.43 7.00 5.75 附图：猪肝中 0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L 和 100μg/L 六个浓度检测结 果总离子流图（TIC）代表图谱： 猪肝+1ppb(PCX) 2222）鸡蛋中三聚氰胺的检测（CleanertCleanertCleanertCleanert PCXPCXPCXPCX,,,, P/N:P/N:P/N:P/N: CX0603CX0603CX0603CX0603） 1111 材料和方法 1.11.11.11.1 主要仪器和试剂， 色谱柱（Venusil ASB C8，4.6*250mm，5μm，艾杰尔科技），混合型阳离子交换固 相萃取柱（Cleanert PCX，60mg/3mL，艾杰尔科技），12位固相萃取装置（艾杰尔科技）， 高效液相色谱仪；高速离心机；超声波震荡仪；涡旋混合器；分析天平（万分之一）；溶剂 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 过滤器（带0.45μm有机、水系过滤膜和真空泵）；乙腈（HPLC级）；三聚氰胺标准品（≥99.0%）； 柠檬酸（分析纯）；庚烷磺酸钠（色谱级）；水（二次蒸馏水以上）。 1.2 色谱条件： 色谱柱：Venusil ASB C8，4.6*250mm，5μm； 流动相：乙腈∶10mM/L柠檬酸+10mM/L庚烷磺酸钠缓冲液=7∶93（pH=3.0） 检测波长：240nm；流速：1mL/min；进样20μL。 2222 实验部分 2.12.12.12.1 三聚氰胺标准溶液配制： 称取三聚氰胺标样10.0mg，加流动相溶解定容至100mL，即得浓度为100mg/L的三聚 氰胺标样溶液。将浓度为100mg/L的三聚氰胺标准溶液分别用水稀释成浓度为1mg/L 、 5mg/L 、10mg/L 、15mg/L 、20mg/L的标准品溶液，用0.45μm滤膜过滤后进液相色谱检 测。 2.22.22.22.2 1%1%1%1%三氯乙酸溶液溶液的配制 称取三氯乙酸1.00g，加水溶解定容至1000mL即得。 2.32.32.32.3 5%5%5%5%氨化甲醇的配制 准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。 2.42.42.42.4 5%5%5%5%醋酸铅溶液的配制 称取5.0g醋酸铅，加水溶解定容至100mL即得。 2.52.52.52.5 混合型阳离子交换固相萃取柱（CleanertCleanertCleanertCleanert PCXPCXPCXPCX 60mg/3mL60mg/3mL60mg/3mL60mg/3mL）的活化 取Cleanert PCX 固相萃取柱，以3mL甲醇，3mL水依次过柱活化，弃去流出液，备用。 2.52.52.52.5 加标样本处理 将鸡蛋打开搅匀，分别称取1.00g鸡蛋样本置于10mL具塞离心管中，分别加入100mg/L 三聚氰胺标样溶液10μl、20μl、100μl，分别得到添加浓度为1.0mg/kg、2.0mg/kg、10.0mg/kg 的样本。 往装有上述样本的具塞离心管中分别加入10mL 1%三氯乙酸溶液，2mL 5%醋酸铅溶 液，摇匀，超声20分钟，8000rpm离心10分钟，全部上清液转入活化好的混合型阳离子交 换固相萃取柱（Cleanert PCX，60mg/3mL），依次使用3mL水，3mL甲醇淋洗，抽干，弃 去淋洗液。最后用5mL 5%的氨化甲醇洗脱（V/V），接收洗脱液，50℃氮气吹干，用1mL 流动相定容，0.45μm滤膜过滤后进液相色谱检测。 另取空白鸡蛋样本1.00g，不添加三聚氰胺照上述方法处理，作为空白对照样品。 3333 实验结果： 3.13.13.13.1 峰型与分离度 分别取鸡蛋空白样品和鸡蛋添加10ppm的样品进样，结果见图1. 图1 鸡蛋空白样品和鸡蛋添加10ppm的样品图谱 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 由图1可见，用该方法处理，三聚氰胺峰型对称尖锐，且与杂质分离良好 3.23.23.23.2 精密度 分别移取浓度为1.0mg/L、5.0mg/L的三聚氰胺标准溶液，分别连续进样6次，结果如表 1所示。 表 1 保留时间与峰面积的稳定性数据 浓度 mg/m L 指标 1# 2# 3# 4# 5# 6# 平均 值 RSD % 1.0 保留时间 （min） 18.83 0 18.82 9 18.82 9 18.83 8 18.84 0 18.83 4 18.83 3 0.02 6 峰面积 89 81 84 88 84 80 84 4.28 6 5.0 保留时间 （min） 18.94 9 18.95 2 18.94 7 18.94 9 18.95 0 18.94 6 18.94 9 0.01 1 峰面积 423 440 438 439 437 438 436 1.46 1 由表1结果可见，本方法具有很好的精密度和重现性。 3.33.33.33.3 标准校正曲线 表 2 标准校正曲线实验数据 浓度 mg/kg 峰面积 第 1 次进样 峰面积 第 2 次进样 峰面积 均值 1.0 89 79 84 鸡蛋空白样品图谱 鸡蛋添加 10ppm 样品图谱 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 5.0 423 440 431 10.0 832 844 838 15.0 1265 1299 1282 20.0 1689 1823 1756 根据以上数据计算线性方程为：y = 87.43x - 13.67， R² = 0.999 ，相关曲线见图2。 图2 浓度与峰面积的回归曲线 结果显示，该方法在1~20mg/kg范围内线性关系良好。 3.4 添加回收率 表3 添加浓度与回收率数据 添加浓度 (mg/kg) 峰面积 计算含量 回收率（%） 1.0 19.9 1.158892 115.89 1.0 21.0 1.214532 121.45 2.0 41.7 2.261587 113.08 2.0 40.8 2.216062 110.80 10.0 188.8 9.702247 97.02 10.0 219.6 11.26018 112.60 由表3可见，本方法检测鸡蛋中三聚氰胺回收率较好。 4444 结论 通过上述实验可见，运用本方法测定鸡蛋中三聚氰胺，基质净化效果好，杂质干扰小， 色谱峰型良好对称度高，操作简单方便，和准确度高等优点，非常适用于鸡蛋中三聚氰胺的 检测。 2222、环境检测应用 1111）水中酚类检测（CleanertCleanertCleanertCleanert PEPPEPPEPPEP,,,, P/N:P/N:P/N:P/N: PE0603PE0603PE0603PE0603） 1111 实验材料： 1.1 SPE 小柱：Cleanert PEP 500mg/6mL 1.2 7 种酚类：苯酚，4-硝基酚，间甲酚，2-氯酚，2,4-二氯酚，2,4,6-三氯酚，五氯酚 2222 实验过程 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 2.12.12.12.1．样品前处理方法 1） 活化：依次用 5mL 甲基叔丁基醚（10:90，V/V）、5mL 甲醇活化富集柱、5mL 去离子 水活化 Cleanert PEP 柱，5mL/min 2） 上样：1L 的水样过柱，<5mL/min 3） 淋洗：10mL 去离子水淋洗小柱，5mL/min，然后真空抽干 20min 4）洗脱：2mL 甲醇/甲基叔丁基醚（10:90，V/V）分两步洗脱，收集洗脱液至尖嘴瓶中 5）浓缩：将收集的 2mL 洗脱液，氮气浓缩至 1mL 2.22.22.22.2．色谱条件 色谱柱：Venusil MP C18(4.6*150,5µm) 流动相：A：1%乙酸 B：1%乙酸甲醇 检测器：UV 检测器 梯度洗脱程序： 时间 流动相比例 流速（mL/min） 检测波长(nm) 0-15min A:B=50:50 1 275 15-30min A:B=15:85 1.8 295 图 1. 七种酚的色谱图 注： 1、苯酚 2、4-硝基酚 3、间甲酚 4、2-氯酚 5、2,4-二氯酚 6、2,4,6-三氯酚 7、 五氯酚 三．实验结果 七种酚在水中的添加回收率见表 1. 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 表 1. 七种酚类在水中的添加回收率结果 加标 平均值 标准偏 差 平均回收 率（%）1 2 3 苯酚 1.367 1.541 1.524 1.477 0.096 100.3 4-硝基 酚 1.229 1.308 1.430 1.322 0.101 90.0 间甲酚 1.294 1.540 1.548 1.461 0.144 106.3 2-氯酚 0.527 0.684 0.641 0.617 0.081 100.6 2,4-二 氯酚 1.305 1.613 1.621 1.513 0.180 92.8 2,4,6- 三氯酚 1.365 1.609 1.511 1.495 0.123 90.3 五氯酚 1.259 1.487 1.472 1.406 0.128 95.6 2222）水中的多环芳烃固相萃取方法（CleanertCleanertCleanertCleanert PEPPEPPEPPEP,,,, P/N:P/N:P/N:P/N: PE0603PE0603PE0603PE0603） 1.1.1.1. 材料 1.11.11.11.1 目标物成分 萘，苊，苊烯，芴，菲，蒽，荧蒽，芘，屈，苯并(a)蒽，苯并(k)荧蒽，苯并(a,h)荧蒽，苯 并(a)芘，苯并(g,h,i)芘，茚并(1,2,3-cd)芘 1.21.21.21.2．SPESPESPESPE柱：CleanertCleanertCleanertCleanert PEPPEPPEPPEP（60g/3mL60g/3mL60g/3mL60g/3mL） 2.2.2.2. 样品处理：1L 水中加入20mL10%的硝酸 3.3.3.3. SPESPESPESPE方法 1） 活化：5mL异丙醇和5mL水分别依次活化PEP柱 2）上样：把处理好的水样过PEP柱 3） 淋洗：用5mL淋洗液（300mL水+700mL甲醇+2.1 g Na2HPO4+2.04 g KH2PO4）淋洗 4）抽干：抽真空干燥柱管30min 5）洗脱：用4mL洗脱液（90mL异丙醇+10mL冰醋酸+200mL甲苯，加入到1L石油醚中）， 混合均匀洗脱，收集洗脱液 6）浓缩，定容 4.4.4.4. 色谱条件： 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 色谱柱：Venusil PAH专用柱（4.6×250mm，5μm，200Å） 样 品：溶于MeOH:CH2Cl2（1:1）16PAHs标品, 用MeOH:CH2Cl2（1:1）稀释10倍 流速：1.2mL/min 进样量：10μL 柱 温：30℃ 波 长：254nm 甲醇/水 线性梯度洗脱，梯度表如下 分析结果： min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 mAU 0 50 100 150 200 250 300 VWD1 A, Wavelength=254 nm (YJ\08082005.D) 3 . 9 4 6 - 2 5 . 9 4 4 - 6 3 . 6 3 8 - 1 4 . 8 8 0 - 4 5 . 3 3 6 - 5 9 . 8 3 6 - 1 0 1 1 . 9 1 9 - 1 1 9 . 2 0 8 - 9 6 . 7 6 0 - 7 4 . 6 2 4 - 3 1 4 . 5 6 0 - 1 3 1 3 . 0 5 3 - 1 2 7 . 3 6 5 - 8 2 0 . 9 7 0 - 1 6 1 9 . 5 0 1 - 1 5 1 7 . 5 7 7 - 1 4 图1 16种多环芳烃供试品色谱图 1、萘； 2、苊；3、苊烯/二氢苊； 4、芴；5、菲；6、蒽；7、荧蒽；8、芘；9、苯并（a） 蒽；10、屈；11、苯并（b）荧；12、苯并（k）荧；13、苯并（a）芘；14、苯并（ghi）； 15、二苯并（a,h）蒽；16、茚并（1，2，3-cd）芘 3333）水中硝基苯的固相萃取方法（CleanertCleanertCleanertCleanert PEPPEPPEPPEP,,,, P/N:P/N:P/N:P/N: PE0603PE0603PE0603PE0603） 1111．SPESPESPESPE柱：Cleanert PEP（500mg/6mL） 2222．样品制备：分析前应先调节水样pH值为中性，向每份水样中加人甲醇使甲醇浓度为0.5%。 混匀。 3333．SPESPESPESPE方法： 3.1 PEP 柱活化：将 PEP 柱置于固相萃取装置的针座圈上，用 3mL 正己烷预洗萃取柱， 加人 5mL 甲醇，在甲醇完全流过萃取柱前加入 10mL 试剂水，使柱床处于湿润和活化状态。 3.2 样品的富集：根据水样浓度准确量取适量水样于分液漏斗中，开启固相萃取装置真空系 统，使水样连续通过活化过的萃取柱保持流速不超过 5mL/min 进行萃取，在萃取过程中要 始终保持柱床上至少有 1cm 高水样。当所有样品都通过萃取柱后，用 10mL 超纯水冲洗分 T（min） MeOH（%） H2O（%） 0 85 15 2 85 15 7 95 5 40 95 5 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 液漏斗内壁，继续真空抽吸 20min。 3.3 干燥柱预处理：向带筛板的干燥管中加入 5g 处理过无水硫酸钠，使用前分别用 10mL 丙酮和正己烷,再以 10mL 丙酮洗以净化干燥柱 3.4 萃取柱的洗脱：保持管线的连接，在真空多管装置的萃取缸中放人试管架及接收管，在 针座圈和萃取柱之间连接干燥柱用于脱水，用 1mL 丙酮过渡，弃去过柱液（该步骤不要吹 干，让丙酮和柱内填料平衡 2min），10mL 正己烷/丙酮(90:10，V/V)洗脱萃取柱，洗脱经过 干燥柱（与 PEP柱串联），收集流出液至接受管中，用氮吹仪在 40℃下浓缩至 1.0mL，进样 分析（需要观察有无分层，水会引起分层，影响氮吹）。 3333、药物分析中的应用 1111）血浆中油酸及其代谢物 LC-MSLC-MSLC-MSLC-MS分析中的应用（CleanertCleanertCleanertCleanert PAXPAXPAXPAX,,,, P/N:P/N:P/N:P/N:AX0603AX0603AX0603AX0603） 1.1.1.1. 油酸结构 2222．提取及净化方法 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 LLLLoadingoadingoadingoading 500ul 样品（加入3%磷酸） EEEElutionlutionlutionlution 1mL1mL1mL1mL 1%1%1%1% 甲酸乙腈 WWWWashingashingashingashing 1mL 1% 甲酸，1mL 甲醇 LC-MSLC-MSLC-MSLC-MS ConditionConditionConditionCondition 1mL 甲醇 EquilibrationEquilibrationEquilibrationEquilibration 1mL 水 3333．检测条件： 仪器：API Qtrap 3200, 美国 Applied Biosystem 公司；LC-20A 高效液相色谱，日本岛津公 司 质谱条件：电离子喷雾源；负离子模式检测；扫描方式为选择反应监测(MRM)方式 用于定量分析的离子反应分别为：m/z 281.2→ m/z 281.2 (油酸)；m/z 315.2 → m/z 315.2(油酸代谢物)；m/z 269.2→ m/z 269.2 (内标 C17) 流动相为：ACN: 3mmol/L ammoniµm acetate=85：15 4444．实验结果 浓度 10ng/mL(n=3)10ng/mL(n=3)10ng/mL(n=3)10ng/mL(n=3) 100ng/mL(n=3)100ng/mL(n=3)100ng/mL(n=3)100ng/mL(n=3) 2500ng/mL(n=3)2500ng/mL(n=3)2500ng/mL(n=3)2500ng/mL(n=3) 油酸 回收 率（%） 77 87 91 RSD 2.9 0.9 0.2 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 图 1 油酸及内标物色谱图 2222）血浆中伪麻黄碱的 LC-MSLC-MSLC-MSLC-MS快速分析（CleanertCleanertCleanertCleanert PCXPCXPCXPCX,,,, P/N:P/N:P/N:P/N: CX0603CX0603CX0603CX0603） 1．伪麻黄碱结构式 pka=9.74 2．前处理步骤（Cleanert PCX 30mg/1mL） 1. 2mL 甲醇， 2mL 水活化 PEP柱 2. 血样以 2% 甲酸稀释后进样 3. 分别以 1mL 水和 1mL 甲醇淋洗 PEP小柱 4. 以 1mL 5% 氨水甲醇洗脱目标物并收集 3333．检测条件 仪器：API Qtrap 3200（美国 Applied Biosystem 公司）；LC-20A 高效液相色谱（日本岛 津公司） 质谱条件： 电离子喷雾源；正离子模式检测；扫描方式为选择反应监测(MRM)方式 用于定量分析的离子反应分别为 m/z 166.0 → m/z 148.1(伪麻黄碱)； m/z 235.3 → m/z 86.1(内标，利多卡因) 油酸代谢物DHSA 油酸 内标C17 中国色谱网论坛在线技术讲座《固相萃取技术原理与应用》 主办：中国色谱网 协办：天津博纳艾杰尔科技 活动联系：0571-28178523 4444．实验结果 表 1 血浆中伪麻黄碱回收率结果 浓度 10ng/mL(n=3) 100ng/mL(n=3) 2500ng/mL(n=3) 伪麻黄碱回收率（%） 77 79 85 RSD 3.5 1.9 0.5 利多卡因回收率（%） 88 92 87 RSD 4.9 2.1 0.3 图 1 伪麻黄碱及内标物利多卡因色谱图 伪麻黄碱 利多卡因