甘西鼠尾草注射液与丹参注射液对PC12细胞H_2O_2损伤保护作用比较研究

◇基础研究 ◇ 中国临床药理学与治疗学 中国药理学会主办 CN 3421206ΠR , ISSN 100922501 E2mail :ccpt96 @21cn. com 2009 Sep ;14 (9) :1036 - 1039 2009206215 收稿　2009209219 修回 甘肃省教育厅资助科研项目 (No :013201) 罗慧英 ,女 ,博士 ,副教授 ,硕士生导师 ,研究方向 :中药药理。 Tel : 093128765348 　E2mail : louria @vip . sina. com 甘西鼠尾草注射液与丹参注射液 对 PC12 细胞 H2 O2 损伤保护作用比较研究 罗慧英1 ,程体娟2 1甘肃中医学院药理教研室 , 2兰州大学药学院药理教研室 ,兰州 730000 ,甘肃 摘要 　目的 :比较甘西鼠尾草注射液与丹参注射 液对 PC12 细胞 H2O2 损伤的保护作用。方法 :采 用细胞株培养的方法 ,建立 PC12 细胞 H2O2 损伤 模型 ,通过 MTT法和流式细胞 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 仪检测细胞存 活率和凋亡率 ;采用免疫细胞化学染色法检测 PC12 细胞 bcl22 和 bax 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达。结果 : PC12 细胞经 H2O2损伤后 ,细胞存活率降低、凋亡率增加 ,甘西 鼠尾草注射液与丹参注射液处理组均可有效缓解 上述改变 ( P < 0. 05) ;两药均使 bcl22 表达增加 ( P < 0. 05) ,bax 表达减少 ( P < 0. 05) 。结论 :甘西鼠 尾草注射液与丹参注射液对 PC12 细胞 H2O2 损伤 具有明显保护作用。其机理可能与增强凋亡抑制 因子 bcl22 表达、抑制凋亡促进因子 bax 表达 ,进 而抑制细胞凋亡有关。 关键词 　甘西鼠尾草注射液 ;丹参注射液 ; PC12 ; H2O2 ; bcl22 ;bax 中图分类号 : R965. 2 文献标识码 : A 文 章 编 号 : 100922501 (2009) 0921036204 丹参 ( Salvia miltiorrhiza Bunge) 注射液对脑缺 血再灌注损伤的保护作用 ,近年来国内外已有大 量报道 ,但对同属植物甘西鼠尾草 ( Salvia przewal2 skii Maxim)的药理作用研究却很少。在前期的实 验中 ,采用永久阻断大鼠大脑中动脉模型 ,证实了 甘西鼠尾草和丹参注射液对大鼠急性脑缺血均有 明显的保护作用 ,其作用基本相同 ,两药都是通过 降低丙二醛 (MDA)含量 ,抑制脂质过氧化 ,降低全 血黏度、全血还原黏度、红细胞压积、红细胞聚集 指数、红细胞刚性指数 ,抑制血小板聚集 ,清除体 内羟自由基来发挥作用的 ,而甘西鼠尾草注射液 对羟自由基的清除作用明显强于丹参注射液[1 ] ; 我们的实验还证实丹参注射液和甘西鼠尾草注射 液对化学性缺氧小鼠的能量代谢均有改善作用。 两药均可延长缺氧小鼠存活时间 ,降低脑组织乳 酸 (LD) 含量 ,提高 ATP 酶活力 ,且甘西鼠尾草注 射液在提高 ATP 酶活力方面优于丹参注射液[2 ] 。 同时甘西鼠尾草注射液与丹参注射液还可改善缺 血再灌注损伤大鼠神经功能缺损 ,降低脑组织中 NOS、NO 含量 , 降低脑血管通透性 ,对脑水肿也有 一定的缓解作用[3 ] 。在体外缓解大鼠大脑皮层神 经细胞谷氨酸损伤方面 ,丹参注射液和甘西鼠尾 草注射液都表现出了良好的效果[4 ] 。本研究旨在 通过建立 H2O2 损伤 PC12 细胞模型 ,对两药的作 用做进一步的比较。 1 　材料与方法 1. 1 　H2 O2损伤 PC12 细胞模型的建立 　PC12 细 胞株 (中国药科大学提供) 在 DMEM 培养基中按 常规方法培养 ,待呈对数生长后加入不同浓度的 甘西鼠尾草注射液与丹参注射液 ,37 ℃、5 % CO2 培养 箱 继 续 培 养 1 h , 然 后 加 入 终 浓 度 为 200μmolΠL 的 H2O2 继续培养 2 h ,造成损伤模型。 1. 2 　MTT法 　将处理过的细胞消化成细胞悬液 (3 ×105 ) 接种到 96 孔板 ,每孔 100μL ,每组 4 个 ·6301· 复孔 ,以不含细胞的 1640 培养液为调零组 ,未做 处理的细胞为空白对照 ,常规培养 48 h 后加 MTT 10μLΠ孔 ,继续培养 4～6 h 后弃上清液 ,加 DMSO 100μLΠ孔 ,充分震荡 ,酶联免疫检测仪 (波长为 570 nm)测每孔的光密度值 (OD 值) 。计算细胞的 存活率。 存活率 ( %) = (实验组 OD 值Π对照组 OD 值) × 100 % 1. 3 　流式细胞仪检测细胞凋亡 　收集并调整 PC12 细胞浓度至 2 ×106 , PBS 液洗涤两次 ,用 70 %的预冷乙醇 4 ℃固定过夜 , PBS 液洗涤两 次 ,加入 RNA 酶 ,PI(100μgΠmL)均匀染色 ,流式细 胞仪检测细胞周期及凋亡率。 1. 4 　免疫细胞化学染色法测 bcl22 和 bax 表达 　 PC12 细胞接种于放有盖玻片 (于前一天用鼠尾胶 原处理)的培养皿中 ,按上述方法加入不同浓度药 物 ,H2O2 损伤 2 h 后取出盖玻片 ,常规免疫组化 ABC法染色。简要步骤如下 :以 40 %多聚甲醛固 定 10 min ,0. 3 % H2O2 处理后用正常羊血清封闭 30 min 滴加 bcl22 多克隆抗体 (1∶75)或 bax 单克隆 抗体 (1∶50) ,室温反应 1. 5 h ,加入 ABC 复合物室温反应 2 h ,DAB 显色 ,明胶封片。光镜下以每张盖玻片中央处为中心视野 ,再取其上下左右视野各 1 个 ,共 5 个视野 ,计算阳性细胞数 ,每组 4 个盖玻片 ,以一个视野为一个样本 ,共计 20 个样本。1. 5 　统计学处理 　所有数据用均数 ±标准差 ( x±s)表示 ,组间比较采用 t 检验。2 　结果2. 1 　甘西鼠尾草注射液和丹参注射液对经 H2 O2处理的 PC12 细胞细胞存活率和凋亡率的影响 　通过MTT法及流式细胞仪检测发现 ,PC12 细胞经H2O2 损伤后细胞存活率明显降低 ,凋亡率增加 ,甘西鼠尾草注射液与丹参注射液均能提高 PC12细胞的存活率 ,减少凋亡的发生 ,当浓度达到125 mgΠmL 及以上时 ,效果更加明显 ( P < 0. 05) ,高浓度的甘西鼠尾草注射液在提高存活率 ,降低凋亡方面要优于等剂量的丹参注射液 ( P <0. 05) ,结果见表 1。 表 1 　对 PC12 细胞 H2 O2 损伤后细胞存活率和凋亡率的影响( x ±s , n = 3) 组别 药物浓度 (mgΠmL) 细胞存活率 ( %) 凋亡率 ( %) 对照组 等容积 95. 2 ±5. 7 2. 1 模型组 等容积 33. 9 ±3. 3b 33. 6b 丹参注射液 31. 25 37. 0 ±1. 6 30. 6 丹参注射液 62. 5 42. 1 ±2. 7 28. 3e 丹参注射液 125 49. 9 ±4. 4e 26. 9e 丹参注射液 250 52. 4 ±2. 4e 21. 7e 丹参注射液 500 59. 8 ±8. 6e 18. 2e 鼠尾草注射液 31. 25 37. 3 ±6. 7 28. 1e 鼠尾草注射液 62. 5 41. 8 ±6. 2 27. 4 鼠尾草注射液 125 47. 4 ±5. 4e 25. 1e 鼠尾草注射液 250 61. 0 ±4. 2ei 22. 2e 鼠尾草注射液 500 71. 2 ±3. 9ei 15. 7e 与对照组比较b P < 0. 05 ;与模型组比较e P < 0. 05 ;与等剂量丹参注射液比较i P < 0. 05 2. 2 　甘西鼠尾草注射液和丹参注射液对经 H2 O2 处理的 PC12 细胞 bcl22 和 bax 表达的影响 　通过 免疫组化检测发现 PC12 细胞经 H2O2 损伤后凋亡 抑制因子 bcl22 表达降低 ,凋亡促进因子 bax 表达 增加 ,即凋亡增加 ,这与流式细胞检测结果相符。 甘西鼠尾草注射液与丹参注射液均能阻遏 H2O2 致 PC12 细胞凋亡抑制因子 bcl22 表达的降低和凋 亡促进因子 bax 表达的升高 ,进而减少凋亡的发 生 ,当浓度达到 62. 5 mgΠmL 及以上时 ,效果更加 明显 ( P < 0. 05) ,125、250 mgΠmL 的甘西鼠尾草注 射液在降低凋亡促进因子 bax 表达方面要优于等 剂量的丹参注射液 ( P < 0. 05) ,结果见表 2。 ·7301·中国临床药理学与治疗学 2009 Sep ;14 (9) 表 2 　PC12 细胞 H2 O2 损伤后 bcl22 和 bax 表达情况(以阳性细胞数计算) ( x ±s , n = 3) 组别 药物浓度 (mgΠmL) bcl22 阳性细胞数 bax 阳性细胞数 对照组 等容积 80. 3 ±4. 2 56. 3 ±8. 8 模型组 等容积 51. 6 ±3. 6b 81. 5 ±7. 6b 丹参注射液 31. 25 51. 9 ±1. 8 80. 3 ±4. 6 丹参注射液 62. 5 62. 4 ±8. 0e 76. 6 ±6. 9e 丹参注射液 125 69. 9 ±4. 2e 77. 3 ±1. 4e 丹参注射液 250 68. 9 ±8. 4e 71. 5 ±5. 8e 丹参注射液 500 72. 3 ±1. 7e 65. 2 ±7. 9e 鼠尾草注射液 31. 25 54. 6 ±9. 5 79. 6 ±9. 0e 鼠尾草注射液 62. 5 59. 3 ±3. 9e 76. 3 ±6. 8e 鼠尾草注射液 125 63. 9 ±6. 5e 70. 2 ±2. 7ei 鼠尾草注射液 250 69. 7 ±2. 3e 65. 3 ±6. 0ei 鼠尾草注射液 500 72. 0 ±5. 4e 64. 9 ±4. 8e 与对照组比较b P < 0. 05 ;与模型组比较e P < 0. 05 ;与等剂量丹参注射液比较i P < 0. 05 3 　讨论 PC12 细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆化 的细胞株 ,以其易获得性和细胞均一性而成为神 经科学离体研究中的重要工具细胞 ,广泛用于神 经细胞分化 ,离子通道、受体和递质释放的实验材 料 ,也是研究神经毒性的最重要的细胞株之一。 在本研究中我们采用 MTT 法和流式细胞仪 检测技术测定了 PC12 细胞的存活率与凋亡率 ,发 现细胞经 H2O2 损伤后存活率明显降低 ,凋亡率增 加 ,甘西鼠尾草注射液与丹参注射液均能提高 PC12 细胞的存活率 ,减少凋亡的发生 ,其中高浓 度的甘西鼠尾草注射液在提高存活率 ,降低凋亡 方面要优于等剂量的丹参注射液。 bcl22 基因为原癌基因 ,目前已发现 5 个 bcl22 基因家族 (bcl22、bcl2x、bax、mcl21 和 A1) ,其中 bcl2 2 可抑制细胞程序性死亡 ( PCD) 。bcl22 的作用机 理可能有 : (1) 抑制 Ca2 + 的释放。bcl22 是一种跨 膜蛋白 ,其主要位于核膜上 ,核内外膜之间由内质 网管腔相连 ,后者是细胞内 Ca2 + 的主要贮存场 所 ,而 Ca2 + 在细胞凋亡过程中起重要作用。应用 转基因方法发现 bcl22 高表达可抑制内质网释放 Ca2 + ,故推测 bcl22 对细胞凋亡的抑制作用可能与 细胞内质网中 Ca2 + 有关[6 - 8 ] 。(2) bcl22 通过阻止 促凋亡基因信号传递 ,或阻止这些诱导基因产物 而发挥抗细胞凋亡作用。研究表明 bcl22 蛋白可 抑制 P53、c2fos 诱导的细胞凋亡等[8 - 9 ] 。(3) bcl22 可通过抑制自由基而发挥抗凋亡作用 ,bcl22 具有 抗氧化剂作用 ,它可抑制超氧化物的产生和作用 , 从而抑制细胞凋亡的发生[6 ,10 ] 。bcl22 对细胞的影 响可被称为“bax 的促死亡相对物”所调节 ,bax2bax 同源二聚体可促进细胞死亡 ,而 bcl222bax 异源二 聚体则抑制细胞死亡 ,bcl22 和 bax 是一对细胞凋 亡的正负调节基因 ,因此 , bcl22Πbax 表达量的比 值 ,对细胞存活与凋亡起着十分重要的作用[11 ] 。 在本实验中 ,PC12 细胞经 H2O2 损伤后 bcl22 表达减弱 ,bax 表达增加 ,丹参注射液和甘西鼠尾 草注射虽不能完全缓解这种改变 ,但是细胞经两 药处理后 , bcl22 表达有所增加 , bax 表达有所减 弱 ,提示丹参注射液和甘西鼠尾草注射液对神经 细胞的保护作用可能与增强凋亡抑制因子 bcl22 表达、抑制凋亡促进因子 bax 表达 ,进而抑制细胞 凋亡有关 ,相关机制还需要进一步探讨。 参 考 文 献 [1 ] 　程体娟 ,杨志勇. 甘西鼠尾草注射液和丹参注射液 抗大鼠急性脑缺血和抗脂质过氧化作用的比较 [J ] . 中国临床药理学与治疗学 , 2003 ,8 (1) :23 - 25. 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Comparison of protective effects on H2 O22induced PC12 injury from S . miltiorrhiza Bunge injection and S . przewalskii Maxim injection LUO Hui2ying1 , CHENG Ti2juan2 1Department of Pharmacology , Gansu College of Traditional Chinese Medicine ; 2Department of Pharmacology , Med2 ical College , Lanzhou University , Lanzhou 730000 , Gansu , China ABSTRACT　AIM : To compare the influence of S . miltiorrhiza Bunge injection (SMBI) and S . przewalskii Maxim injection ( SPMI) on H2O22induced injury in PC12. METHODS : PC12 cells were cultured in vitro to compare the protective effects of SMBI and SPMI on cell injury induced by H2O2 . The survival rate was measured by MTT method , and the apoptosis rate of PC12 cells was detected by flow cytometry ,the protein expressions of bcl22 and bax in PC12 cells were detect2 ed by immunocytochemistry staining method. RE2 SULTS : When PC12 was damaged by H2O2 , the rate of cell survival was degraded ,and the rate of apoptosis was increased. SMBI and SPMI could alleviate the de2 stroy effectively(P < 0. 05) , they both could strength2en the expression of bcl22 ( P < 0. 05) and lighten thatof bax( P < 0. 05) . CONCL USION: The results sug2gested that SMBI and SPMI had comparable protectiveeffect on H2O22induced injury in vitro. The main ef2fects of both injections were related to strengthening theexpression of bcl22 and lightening that of bax.KEY WORDS 　S . miltiorrhiza Bunge injection (SM2BI) ; S . przewalskii Maxim injection ( SPMI) ; H2O2 ;apoptosis ;bcl22 ;bax 本文编辑 :钟正灵 ·9301·中国临床药理学与治疗学 2009 Sep ;14 (9)