微生物实验

微生物学实验指导 微生物学实验指导 实验一 培养基的制备与灭菌 一、实验目的 学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、实验内容： 1．牛肉膏蛋白胨培养基的配制。 2．高氏1号培养基的配制。 3．马丁氏培养基的配制。 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/L H Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布 三、操作步骤 (一 )牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下: 牛肉膏3g，蛋白胨l0gNaCl 5g，琼脂15-20g, 水1000mL，pH 7.4—7.6 1. 称量。按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2. 加热溶解。在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 3. 调pH。检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/LHCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4. 过滤。液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，此步可省略。 5. 分装。披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积内一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/4为宜．灭菌后垂直待凝。 6. 加棉塞。试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法则图1－1。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利透气的作用。要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的透气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料盖代替棉塞。 7. 包扎。加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包—层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 8. 灭菌。将上述培养基于121．3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况没能及时灭菌，则应放人冰箱内暂时保存。 9. 摆斜面。灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面长度不超过试管总长的一半。 10. 无菌检查。将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h，无菌生长时可以使用，或放置在冰箱或清洁的橱内，备用。 图1-1 棉塞的制作过程 (二)高氏1号培养基的配制 高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，k2S04·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 1g，琼脂15—20g, 水1000mI，pH 7.4-7.6。 1. 称量和溶解。经计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放人小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解，再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4.7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4.7H2O，配成浓度为0.01g／mL的贮备液，再在1000ml培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白脏培养基配制。 2. pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查，与牛肉膏蛋白胨培养基配制方法同。 (三)马丁氏培养基的配制 马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：K2HPO4 1g，FeSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15-20g，水1000mI，自然pH。 1. 称量和溶解。先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1％的水溶液，在1000ml培养液中加人以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2. 分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋自胨培养基配制。 3. 链霉素的加入。链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降全45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1％的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在1000mL培养基中加1％链霉素0.3mL，使每毫升培养基中含链霉素30ug。 注意事项: 称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖：调pH时要小心操作，避免回调。 (四)高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。 1. 加水。将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为宜。 2. 装料。将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以免冷凝水沾湿棉塞。 3. 加压。将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀。 4. 排气。用电炉或煤气加热，待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出. 一般排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内空气已排净(沸后约5min)。 5. 升压。当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。本实验用121℃，20min灭菌。 7. 降压。达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀，放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。 8. 无菌检查 将已灭菌培养基于37℃培养24h，无杂菌生长，即可待用。 四、演示 1. 培养基的分装方法； 2. 试管斜面的搁置方法； 3. 灭菌锅的使用方法。 六、实验 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 记录本实验配制培养基的名称、数量，说明其配制过程，指明要点。 七、问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 和思考 1. 配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2. 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？如何进行无菌检查， 3. 试设计实验对饮料进行无菌检查。 实验二 从土壤中分离和纯化微生物 一、实验目的和内容 目的：学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。 二、实验内容 1. 用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。 2. 用平板划线法分离微生物。 3. 学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。 三、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通变形菌(Protues vulgaris)斜面菌种。 已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶，495mL无菌水(带玻璃珠)1瓶、4.5mI无菌水6管、80％乳酸、10％酚液、95％乙醇。 无菌培养皿12套、1mL的无菌移液管10支、土壤样品、天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮皮头(用75％乙醇浸泡)、涂布器。 三、操作步骤 (一)土壤稀释分离 1. 取土壤。取表层以下5—10cm处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。 2. 制备稀释液 (1) 制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底为最好)，振荡5-10min使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。 (2) 稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0．5mL．放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3一10-8的稀释液(图2-1)。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用1支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于一次，以减少稀释中的误差。 图2-1 稀释法分离土壤微生物操作过程图解 3．稀释倒平板法测定菌落数的方法 (1) 细菌：取10-6、10-7两管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底的2／3为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作，见图3-2。 图2-1 倒平板的方法 (2) 放线菌：取10-5、10-4 两管稀释液各1mL，在每管中加入10％酚液5-6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。 (3) 霉菌：取10-5、10-4两管稀释液各1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。在溶好的土豆蔗糖培养基中，每100mL加入灭菌的乳酸1mL，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法例入平皿中，便可制成霉菌的平板。 4．培养。将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28℃-30℃恒温培养,细菌培养1—2d，放线菌培养5—7d，霉菌培养3—5d可用于观察菌落，用于进一步分离纯化或直接转接斜面。 (二)平板划线分离微生物 1．倒平板。按无菌操作要求，在火焰旁操作(图2-2)，取融化并冷却至不烫手的固体培养基(约50℃)，倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固，备用。 2．划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样．在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见图2-3。 3．培养 方法同“土壤稀释分离”。 (三)斜面接种和穿刺接种 1．斜面接种 (1) 取新鲜固体斜面培养基。分别做好标记(写上菌名、接种日期、接种人等)，然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面中。 (2) 接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后在新鲜培养基面上〝之〞字划线,,方向是从下部开始,一直到上部。 (3) 接种后30℃恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。 图2-3 平板划线方法示意图 2．穿刺接种 (1) 取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记(写上菌名、接种日期、接种人等)，分别接入金黄色葡萄球菌和普通变形菌。 (2) 接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种．然后从柱状培养基的中心穿入其底部(但不要穿透)、然席沿原刺人路线抽出接种针．注意接种针不要移动(图3—4B) 。 (3) 接种后30℃恒温培养．24h后观察，比较两种菌的生长结果。 图2-4 斜面接种（A）及穿刺接种（B）示意图 四、注意事项 1. 一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之．而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤个分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落达成一片不能计数。 2. 在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。 3. 放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。 五、演示 1. 土壤稀释分离法操作； 2. 平板制作及划线分离方法； 3. 斜面接种； 4. 穿刺接种。 六、实验报告 1. 记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量 计算方法：选择长出菌落数30一300之间的培养皿进行计数, 按以下公式： 总菌数／g＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数 2. 分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。 3. 比较两种细菌穿刺接种的结果，并进行 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。 七、问题和思考 1．在测定土壤微生物含量中，除混菌法外还用什么方法? 2．试设计实验，从土壤中分离出酵母菌．并进行计数。 实验三 细菌革兰氏染色法及芽孢染色法 一、实验目的 1. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤； 2. 掌握细菌芽孢染色的方法。 二、实验内容 1. 制作细菌染色装片。 2. 进行革兰氏染色法操作。 三、实验材料和用具 大肠杆菌(E．coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液，枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的斜面菌种。 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯和5％孔雀绿水溶液。 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯和烧杯。 四、操作步骤 (一) 革兰氏染色 1．涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 2. 干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 3．固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法．即将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止茵体烧焦、变形。此制片可用于染色。 4. 初染 于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。 5. 媒染 滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。 6. 脱色 滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min水洗。 7. 复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。 8．用滤纸吸干,油镜镜检。 (二)芽孢染色法 1．方法1 (1) 取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”) 。 (2) 于载片上滴人3—5滴5％孔雀绿水溶液。 (3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时开始计算时间约4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 (4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5) 用0.5％沙黄水溶液(或o．05％碱性复红)复染1min，水洗。 (6) 制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。 2．方法2 (1) 加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环培养18—24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分期匀打散，制成浓稠的菌液。 (2) 加5％孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中．用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 (3) 将此试管浸干沸水浴(烧杯)中，加热15—20min。 (4) 用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。 (5) 水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为比。 (6) 加沙黄水溶液，染2—3min后，倾去染液，不用水洗。 (7) 干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。 (三) 结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色, 革兰氏阳性菌染成淡红色。 (四) 检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色呵芽孢染色，并绘图、记录染色结果。 五、注意事项 1．涂片务求均匀．切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌。 4．老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 5．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽泡仍保留在菌体上为宜。 六、演示 1. 无菌操作取菌、涂片及涂片的固定； 2. 制片方法及染色过程。 七、实验报告 (一) 绘图 大肠杆菌革兰氏染色视野图； 金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图； 枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。 (二) 记录革兰氏染色法步骤，并进行结果分析。 (三) 未知菌的检测结果。 七、问题和思考 1．涂片后为什么要进行固定，固定时应注意什么? 2. 什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 3. 试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。 4. 为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色? 实验四 油镜的使用和细菌形态的观察 一、 实验目的 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术．了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸的使用方法。 二、实验内容： 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．用油镜观察枯草芽抱杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。 三、实验材料和用具 枯草芽孢杆菌(Bacillus .subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色装片。 香柏油、二甲苯、 显微镜、擦镜纸 。 四、操作步骤 (一) 观察前的准备 1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。坐正， 练习 飞向蓝天的恐龙练习非连续性文本练习把字句和被字句的转换练习呼风唤雨的世纪练习呼风唤雨的世纪课后练习 用左眼观察。 2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。 3. 低倍镜观察染色装片 首先下降载物台，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈,然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部分移至视野中心. 4. 高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与破片相撞。再用目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。 5. 油镜观察 (1). 下降载物台约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴香柏油。 (2). 从侧面注视，小心慢慢上升镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。 (3). 将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将载物台徐徐下降(切忌反方向旋转)，直至视野中有物像为止。 （二）细菌形态的观察 1. 观察细菌的基本形态 用低倍镜、高倍镜和油镜观察革兰氏染色的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，芽胞染色的苏去金杆菌，并分别在油镜下绘图。 五、注意事项 1．注意擦镜头时，只能用擦镜纸。 2．观察完毕，必须将镜筒上升，才能取下装片．放入另一装片后，要按使用油镜要求，重新操作．不能在油镜下直接取下和替换装片，切记。 3．无菌操作过程中，接种环灭菌后不能触及其他物品，挑菌不能过多。 六、演示 1．细菌细胞结构装片示范镜； 2．无菌操作过程； 3．怎样盖盖玻片才不产生气泡。 七、实验报告 （一)绘图 给出你所观察到的几种细菌的个体形态视野图。 绘出你所观察到的细菌细胞结构视野图，并注明各部分。 （二)试指出在制备活菌装片时，应注意什么问题? 八、问题和思考 1. 用明视野显微镜观察细菌的形态时，你认为用染色装片好还是用非染色装片好？观察活体装片与染色装片，光线调节各有什么不同? 2. 无菌操作过程中，可否将棉寒放在桌面上?为什么? 3. 试设一个准备该实验的工作 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。 实验五 放线菌、酵母菌和霉菌形态观察 一、实验目的 1．观察细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的代表种类的菌落形态特征。　　 2．放线菌、酵母菌和霉菌的细胞形态观察。 二、实验原理　　 菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。 三、实验材料和用具 圆褐固氮菌，枯草芽孢杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉的单个菌落平板，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；Bouin氏固定液，0.01％结晶紫溶液，酒精等。 显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环。 四、操作步骤 （一）四大菌落的形态观察 观察圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、青霉的单个菌落特征，并按实验菌落特征描述的方法记录结果。　　 （二）放线菌的形态观察 用镊子小心取出用插片法培养的放线菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。 （三）霉菌的形态观察 1．粘片观察：取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。 2．假根观察：将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。 （四）酵母菌的形态观察 酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定 1．以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。 2. 取0.05%美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。 3. 在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6个视野。 酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算： 死亡率=死细胞总数／死活细胞总数×100% 五、注意事项 1．用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润；在产孢培养基上加大移种量，可提高子囊形成率；通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。 2．培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。 3．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长， 六、实验报告 1. 将观察到的微生物菌落特征填入下表中。 2. 计算酵母菌的死亡率 3．根霉和青霉形态图，示各部。 七、问题和思考 1. 试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态的差异？      2．酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别? 3．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝? 实验六 微生物显微计数和大小测量 一、实验目的和内容 目的：学会测微尺的使用和计算方法及对球菌和杆菌的测量 内容： 1．认识测微尺，学习目镜测微尺的标定。 2．测定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌体的大小。 3．计数板直接镜检计数。 4．载玻片直接镜检计数。 5．平板菌落计数。 二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)斜面培养物(约培养 10h)、培养 5—7d 的大肠杆菌(E.coli)菌液。 牛肉膏蛋白胨培养基、美蓝染色液、；结晶紫染色液、香柏油、二甲苯。 显微镜、血细胞计数板、目镜测微尺、酒精灯、镜台测微尺、擦镜纸、酒精灯、滤纸条、载玻片、盖玻片、无菌微量移液管、接种环、无菌试管、涂布器、无菌培养皿。 三、操作步骤 (一)计数板直接镜检计数 1．血细胞计数板的构造 血细胞计数板由四条平行槽构成 3个平台，中间的平台较窄，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台面各有一个含 9 个大格的方格网，中间大格为计数室。计数室的长和宽各为l mm，中间平台下陷 0.01 mm，故盖上盖玻片后计数室的总容积为 0.1 mm3。血细胞计数板的构造见图 16. 常见血细胞计数板的计数室有两种规格。一种是 16x 25 型，称为麦氏血细胞计数板．共有 16个小格，每个小格分为 25 个小格。另一种是 25x16 型，称为希里格式血细胞计数板，共有 25 个中格，每个中格又分成 16 个小格。但是不管哪种规格的血细胞计板其计数室的小格均由 400 个小方格组成。应用血细胞计数板在显微镜下直接计算微生物细胞的数量，方法是先测定若干个方格中的微生物细胞，再换算成每 m1 菌液(或每 g 样品)中微生物细胞数量。 2．细菌数量的测定 (1) 稀释加样：取枯草芽孢杆菌斜面少量菌体至 100mL无菌水中，稀释混匀后待用(浓度约为 104 - 105／mL)。先将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取以上稀释液滴于盖玻片的边缘，让菌液自行渗人，多余菌液用滤纸吸去，稍待片刻，待细菌细胞全部沉降到计数室底部，将计数板放于载物台的中央，按下列步骤寻找计数室并计数。 (2) 找计数室：先在低倍镜下寻找计数板大方格网的位置，转换高倍镜后．调节光亮度至菌体和计数室线条清晰为止，再将计数室一角的小格移至视野中。顺着大方格线移动计数板，使计数室位于视野中间。 (3) 计数：计数时，如用 16x 25 则计数板则按对角线方位，取左上、右上、左下、右下 4 个大格(共4 个大格，100 个小格)内的细胞逐一进行计数；如使用规格为 25×16 型的计数板，则除取左上、右上、左下、右下 4 个大格外，还需加中央的一个大格(共 5 个大格，80 个小格)内的细胞。计数时当遇到大格线上的细菌时，一般只计此大格的上方及右方线上的细胞(或只计下方及左方线上的细胞)，将计得的细胞数填人结果表中．对每个样品重复计数 3 次，取具平均值，按下列公式计算每 mL 菌液中所含的细菌细胞数。 (二)载玻片直接镜检计数 1．摇动菌液使其混合均匀，用无菌微量移液管取菌液 0.01mL于载玻片上．并用无菌接种环均匀地涂布 1cm2的面积上。风干，固定，结晶紫染色lmin，冲洗．干燥备用。 2．用物镜测微尺，测量显微镜油镜观察时的视野直径，并以S=πr2 公式，计算出视野面积。 3．将涂片置于载物台，滴香柏油，以油镜观察，不断变化视野．共观察 N 个视野，计数每一视野中细菌个数。以下列公式计算每毫升菌液中的含菌数量： 图6-1 血细胞计数板 (三)平板菌落计数 另取灭菌移液管吸取上述枯草芽孢杆菌稀释液 1mL，放人已灭菌的培养皿中，再倒人融化而冷却到 50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,同时制作 3 个平板．皿中铺成—薄层，并使平皿作前后和左右滑动，使样品和培养基混匀．待其凝固后倒置，37℃培养 24 h 后汁算菌落数，并计算其每 mL的含菌量。 （四）细菌大小测定 l．测微尺的构造 显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成，目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在 5mm 刻尺上分 50 份(图 15—1B)。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。镜台测微尺为—专用中央有精确等分线的载玻片(图 15—1A)，一般将长为 1mm的直线等分 100个小格，每格长 0.01mm, 即 10um，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。 2．目镜测微尺的标定 把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放入目镜的隔板上．使有刻度的一面朝下。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行．并使两尺左边的一条线重合，向右另外一条两尺相重合的直线(图 15—1B)、 3．计算方法 ： 例如，目镜测微尺 20 个小格等于镜台测微尺 3 个小格，已知镜台测微尺每格为 10um，则 3 小格的长度为 3×10＝30um，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为 3X10÷20＝1.5(um)。用以上计算方法分别校正低倍镜,高倍镜及油镜下目镜测微尺每格实际长度。 图6-2 镜台测微尺(A)与目镜测微尺(C)及其校正方法(B) 4．菌体大小的测定 将镜台测微尺取下，分别换上大肠杆菌及金黄色葡萄球菌玻片标本，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。并详细记录于表中。 例如．目镜测微尺在这架显微镜下，每格相当于 1.5 um，测量的结果，若菌体的平均长度相当于目镜测微尺的 2 格．则菌体长应为 2×1.5 um＝3.0um。 一般测量菌体的大小．应测定 10 - 20 个菌体．求出平均值．才能代表该菌的大小。 四、注意事项 1．镜台测微尺的玻片很薄，在标定油镜头时，要格外注意，以免压碎镜台测微尺或损坏镜头。 2．标定目镜测微尺时要注意淮确对正目镜测微尺与镜台测微尺的重合线。 3．直接镜检计数完毕，用蒸馏水冲洗计数板。绝不能用硬物洗刷。洗后待自行晾干．或用滤纸沾干。最后用擦镜纸擦干净。若计数是病原微生物，则需先浸泡在 5％的石炭酸溶液中进行消毒，然后再进行清洗。 五、演示 1．目镜测微尺、镜台测微尺的显微镜下示教 2．标定及测量方法示范。 3．显微镜下显示计数板计数室。 4．平板菌落计数操作过程。 六、实验报告 1. 目镜测微尺标定结果： 低倍镜下 倍目镜测微尺每格长度是 高倍镜下 倍目镜测微尺每格长度为 油镜下 倍目镜测微尺每格长度是 2．菌体大小测定结果： 试与已知的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的大小作一比较是否一致，为何? 计数板直接镜检计数结果： 4. 涂片直接镜检计数结果： 5. 平板菌落计数结果 七、问题和思考 1． 根据你的体会，血细胞计数板计算的误差主要来自哪些方面?应如何减少误差? 2．比较各种计数法的优点和缺点。 3．设计一个方案．如何计数市售酸奶或三株口服液或菌肥制品的单位含菌数。 4. 为什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时必须重新用镜台测微尺对目镜测微尺进行标定? 5. 若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么目镜测微尺每格所测量的镜台上的菌体细胞的实际长度(或宽度)是否相同?为什么? 实验七 E.coli生长曲线的测定 一、实验目的 1 了解细菌生长曲线特点及测定原理； 2 学习用比浊法测定细菌的生长曲线。 二、基本原理 三、器材 1菌种：大肠杆菌 2培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 3仪器和器具： 四、方法与步骤 1标记编号 取11支无菌试管，分别用记号笔标明培养时间，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h。 2接种 用5.0 mL无菌吸管分别准确吸取2.5 mL种子液加入盛有50 mL牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶中，混合均匀后分别取5.0 mL混合液放入上述标记的11支无菌试管中。 3 培养 于37℃下振荡培养250 r/min，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h，将标记有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。 4生长量测定 将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长进行比浊测定。并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。 五、实验结果 1 将测定的OD值填入下表： 2 以上述表格中的时间为横坐标，OD600 值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。 3思考： （1）用本实验方法测定微生物生长曲线，有何优点？ (2) 细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为103/ml，培养4.5h后，其密度高达2×108/ml，计计算出其代时。 实验八 细菌的生理生化反应 实验目的 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同的微生物有着不同的酶系统； 掌握进行微生物大分子物质水解实验的原理和方法 掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法； 了解IMViC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 实验原理 （请补充） 实验器材 （请补充） 实验步骤 淀粉水解试验： 用记号笔在淀粉培养基平板底部划分4部分。 将Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes，staphylococcus aureus分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别写上菌名。 将平板倒置37℃生化培养箱中培养（A-509），24 h后观察各种细菌生长情况：打开盖子，滴入少量卢戈氏碘液，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺面整个平板。 糖发酵试验： 用记号笔在试管外壁上分别表明表明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。 取3支含糖发酵培养基的试管，其中2支分别接种Escherichia coli，Enterobacter aerogenes，另外1支保留不接种的培养基为对照。 37℃恒温培养24 - 48 h后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性，不变或变蓝为阴性；倒立德汉氏小管中如有气泡，表示代谢产气。 实验结果记录：产酸产气用“⊙”表示，只产酸的用“+”表示，不产酸不产气的用“﹣”表示。 吲哚试验 将Escherichia coli，Enterobacter aerogenes，分别接种于2支蛋白胨水培养基中，37℃恒温培养24 h。 在培养基中加入乙醚1.0 mL ,充分振荡使吲哚溶于乙醚中，静置2 min，待乙醚层浮于培养液上面后，再沿试管壁慢慢加入吲哚试剂10滴。乙醚层呈玫瑰红色的为阳性。注意：加入试剂后，不许摇动，否则无红色或红色不明显。 甲基红（M. R.）试验和伏-普（V. P.）试验 将Escherichia coli，Enterobacter aerogenes，分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃恒温培养24 h。 M. R.试验：各取出1支培养好的试管，取沿管壁加入M. R. 试剂3 – 4滴，观察，培养基由原来的橘黄色变为红色的为阳性反应。 V. P.试验：各取1支培养好的试管，加入10滴40%的KOH，然后加入等量的5%的α-萘酚溶液，用力振荡，37℃恒温15 - 30 min，培养物呈红色的为阳性反应。 实验结果（表格见黑板） 结果分析（对实验进行总结与分析） 实验九 环境因素对微生物生长的影响 一、实验目的 学会自己设计实验测试一些环境因素对微生物生长的影响的方法与步骤。 掌握物理因素、化学因素、生物因素对微生物生长的影响的原理。 掌握培养基的配置及灭菌方法。 了解并会使用微生物实验室的基本仪器及常用灭菌方法。 二、实验原理 微生物的生命活动是由其细胞内外一系列物化环境系统统一体所构成的，除营养条件外，影响微生物生长的环境因素，包括物理因素、化学因素和生物因素对微生物的生长繁殖、生理生化过程均能产生很大影响，总之一切不良的环境条件均能使微生物的生长受抑制，甚至导致菌体死亡。 物理因素——pH PH通过影响细胞质膜的通透性，膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。 2、化学因素——消毒剂（碘酒） 通过诱导细胞裂解的方式杀死细胞。 生物因素——抗生素（青霉素） 能抑制微生物生长或杀死微生物的化合物，它们主要通过抑制细菌细胞壁合成，破坏细胞质膜，作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化，抑制蛋白质和核酸合成等方式来抑制微生物的生长或杀死微生物。 三、实验材料 菌种：3号金黄色葡萄球菌、5号大肠杆菌 仪器：高压灭菌锅、电子天平、电热炉、恒温培养箱、紫外分光光度计、移液枪、打孔器 器皿：玻璃棒、大烧杯、锥形瓶、试管和培养皿（使用时灭菌）、接种环、涂布棒枪头 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏，蛋白胨，NaCl,琼脂粉，水，PH7.2~7.4） 牛肉膏蛋白胨培养液（同上，不加琼脂粉） 无菌水 1mol/L HCL 1mol/L NaOH 四、实验步骤 1. pH对微生物的影响 （1） 配置不同PH值得培养基，0.3克 牛肉膏、1克蛋白胨、0.5克氯化钠、100毫升的水。从最低PH 值开始调：3.5、5.5、7.5、9.5、11.5五个PH浓度各5毫升分装十支试管，即每个梯度做两管。进行标记后灭菌。 （2） 制备菌液，取37摄氏度培养了15小时的大肠杆菌斜面一支，挑取两环菌群至4毫升的无菌水中，混匀后待用。 （3） 滴加菌液，用移液抢向第一步中准备好的十支试管中分别加200微升的菌悬液，混匀后在37摄氏度下培养24小时。 （4） OD值得测定，将培养好的菌液混匀后用721光电比浊法测各试管的OD值并做记录。 2. 碘酒试验 （1）. 配置固体培养基，取0.6克牛肉膏、2克蛋白胨、1克氯化钠、3克琼脂、200毫升水。加热溶化琼脂后，将PH调至7.5，装入锥形瓶中封口灭菌备用。 （2）倒平板，将第一步制好的培养基溶化后冷却到50至60摄氏度后倒平板，每个培养皿15毫升，共倒10个平板，其中四个做碘酒试验，对这四个平皿做碘酒和接种菌的标记。另六个培养皿是为下一个实验抗生素实验准备的。 （3）菌悬液制备，取37摄氏度培养了15小时的活化菌种，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别挑取3环分别加入两个4毫升的无菌水中混匀备用。 （4）碘液梯度稀释，取2.5%的碘酒1毫升加入4毫升自来水混匀，依次稀释制备成0.5%、0.1%、0.02%、0.004%的碘酒梯度。 （5）涂布平板并加滤纸片，用移液抢吸取200微升菌悬液至培养皿中均匀涂布（两种菌每个涂两个平板），将滤纸片分别在不同浓度的碘酒液中浸湿后轻轻放在对应标记浓度和菌样的培养皿中，一个培养皿做两个梯度，每个梯度放3个滤纸片。 （6）将培养皿在37摄氏度下恒温培养24小时后测量每个滤纸片的抑菌斑大小并做记录。 3、青霉素对微生物生长的影响 （1）制备菌悬液，取37摄氏度下培养了15小时的活化菌种（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面各一支）分别挑取3环分别加到4毫升无菌水中，制成两种菌的菌悬液。 （2）梯度稀释青霉素，将40万单位的青霉素依次稀释为5万、1.25万、0.312万、0.078万、0.015万单位。 （3）涂布，用移液抢吸取200微升菌悬液至培养皿中（碘酒试验已经备好），两种菌各涂3个平板。用标记笔将六个平板从中间划线，以备加六种浓度的滤纸。 （4）加滤纸片，将滤纸片在分别不同浓度的青霉素液浸湿轻放于对应浓度的平皿中，每个浓度放3个滤纸片，一个平板做两个浓度，然后在37摄氏度下恒温培养24小时。 （5）测量，将各浓度下的滤纸片的抑菌斑直径测量出来，并做记录。 、实验结果及分析 PH值对微生物生长的影响 PH值 试管1 试管2 平均值 碘酒对微生物生长的影响 菌种 浓度（%） 直径（cm） 平均值 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 注：滤纸片直径0.5cm 3.青霉素对微生物生长的影响 菌种 浓度（%） 直径（cm） 平均值 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌