牛催乳素基因组及其 !"#$全长
序列的分子克隆和分析
曹 新，王 强，颜景斌，阳飞昆，黄淑帧，曾溢滔!
（上海市儿童医院上海医学遗传研究所，上海 !"""#"）
摘要：通过 $%&’ ()*等技术首次克隆得到全长 +,--./的牛催乳素（ !"#$）基因组序列（01&23&4登录号 56#!7,89），
其中包括 !"#$基因全部 9个外显子和 #个内含子，9:端 -9#./的上游调控区以及 ,:端 7+./的 ;<*。56#!7,89基因
编码的蛋白质在 01&23&4中的序号为 55$!-"=9，由 !!+个氨基酸残基组成，8 > ,"位氨基酸残基为信号肽序列，成
熟的多肽含有 8++个氨基酸残基。将 !"#$ 基因组 ?@5真核
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
达载体转染 )ABC=细胞后通过 *
)(-!(2
)5A LM&，N5@0 JM3&’，O5@ PM&’C2M&，O5@0 61MCQR&，S;5@0 BTRCUT1&，UI@0 OMC<3%!
（%&’()&’* +(,-*-.-/ 01 2/3*4’5 6/(/-*4,，%&’()&’* 7&*538/(’, 90,:*-’5，%&’()&’* !"""#"，7&*(’）
$?27+*!7：V& GTMF W1/%WG，3 XREECE1&’GT F1YR1&D1 %X .%ZM&1 /W%E3DGM&（ !"#$）’1&%HMD ?@5 [MGT +,--./，
[TMDT T3F .11& 3DD1/G1\ .] 01&23&4（5DD1FFM%& @RH.1W：56#!7,89），[3F XMWFGE] DE%&1\ .] $%&’ ()*
/W%D1\RW1F ^ ," FMG1F 3&\ H3GRW1 /%E]/1/GM\1
D%&FMFGF %X 8++ 3HM&% 3DM\ W1FM\R1F ^ ==,，!""!
!"#$ %&’&#("$ )(’("$
!"#$%&’% (
!"# $%&’(：)"#* +,-；."’/#% 0&"12!3/#；4"1%!512& !1"#/#*；$%65%#!% 2#217$/$
催乳素（0&"12!3/#，+-)）是脊椎动物腺垂体分泌
的单链多肽类激素，属于生长激素 8催乳素家族。
+-)通过与靶细胞膜表面的催乳素受体（0&"12!3/#
&%!%03"&，+-)-）结合，启动 9:;< 8 =>:>? 信号传导途
径，最终激活反式作用因子 =>:>?，使其作用于乳蛋
白基因启动子区的靶序列，启动或增强以乳蛋白基
因启动子为作用元件的靶基因（包括外源基因）的表
达［@，<］。催乳素在促进哺乳动物个体的乳腺发育、
乳汁生成、发动和维持泌乳方面发挥重要作用［A］，所
以深入研究 +-) 对通过乳腺生物反应器高水平表
达目的基因产品具有重要意义。
牛催乳素（."’/#% 0&"12!3/#，!"#$）基因定位于第
L+,-
获得其全长 !HI:，也在细胞水平上证实了 !"#$ 基
因组 HI:具有生物学功能，为通过牛催乳素和转基
因动物技术来构建乳腺生物反应器的研究奠定了重
要的基础。
) 材料和方法
) () 菌株、质粒和细胞
大肠杆菌 >M+ @BJN受体菌（本所保存），0!
HI:A(@ 8 O%&" P%!3"&（Q#’/3&"*%#，R=:），0DSTL> P%!3"&
C/3（+&"4%*2，R=:），,M=LU细胞株（购自中国科学院
上海生化与细胞生物学研究所）。
) (* 主要试剂
D%#% :40V) +,- C/3（+%&C/# S14%&，R=:），->L
+,- C/3（D/.!" E-)，R=:），>G HI: 1/*2$%（R=E，
R=:），>2;2-2 %& ’()（>2;2-2，9202#），聚乙二醇
WBBB（=/*42，R=:），HM>:+（E"%X&/#*%& T2##X%/4，
D%&42#7），@KGB培养基（D/.!" E-)，R=:），小牛血清
（Y7!1"#%，R=:），胰蛋白酶（H/Z!" 进口分装），B (
?4"1 8 ) SH>:（D/.!" E-)，R=:），*+,E!等限制性
内切酶购自 I%[ S#*12#\ E/"\公司。
) +, !"#$ 基因组 -./序列的克隆
@ (A (@ 牛高分子量基因组 HI: 抽提 按文献
［G］的方法从枸橼酸钠抗凝的健康成年黑白花奶牛
（本所奉新动物试验场）外周静脉血中抽提高分子量
的牛基因组 HI:，电泳检测，紫外分光光度仪定量。
@ (A (< 长距离 +,-（)"#* +,-） D%#E2#C数据库
查询获得 .+-)的 A个不连续的核苷酸序列，据此 A
个有限的核酸序列利用 +&/4%& \%$/*#%& A (B软件设计
G条 )"#* +,-引物。引物 E+@位于 !"#$ 基因的上
游调控区；E+G位于 AN端 R>-；E+K和 E+U位于第一
内含子中，部分 !"#$ 核苷酸序列和 )"#* +,-引物
位置如图 @所示。
图 @ !"#$基因组 HI:片段和 )"#* +,-引物位置
J/*(@ J&2*4%#3$ "Z ."’/#% 0&"12!3/# *%#"4/! HI: 2#\ 0&/4%& 1"!23/"#$ "Z )"#* +,-
以牛基因组 HI: 为
模板
个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载
，参照 D%#% :40V)
+,- C/3 提供的说明书进行 )"#* +,- 反应：FG]
?4/#；（FG] @?$%!，KG] W4/#）^ @K 个循环；（FG]
@?$，KG] W4/#）^ @< 个循环，每循环后延伸时间增
加 @?$；U<] @B4/#。
@ (A (A !"#$ 基因组 HI:真核表达载体的构建
FKUF期 曹 新等：牛催乳素基因组及其 !HI:全长序列的分子克隆和分析
引物 !"# $ !"%和 !"& $ !"’的 ()*+ ",-扩增产物回收
后连入 ./0123载体，转化大肠杆菌 3). #456感受态
细胞，蓝白斑筛选重组克隆，选择合适的限制性内切
酶鉴定后进行 789序列测定，其克隆分别编号为 !"#
: %和 !"& : ’。克隆 !"# : %和 !"& : ’分别用限制
性内切酶 !"#!$ $%&!!和 $%&!!$ ’()!消化，然后通过
!"#!*’()!位点克隆入真核表达载体 .;789<= # $ >?@)
（ A）中。
! "# $%&’ ()*+序列的克隆
# =& =# 真核细胞转染 ,BC : ’细胞株在含#4髎
小牛血清的 -"1D2#%&4 培养液中 <’E、F 髎 ,BG 饱
和湿度条件下培养。当细胞生长至 &4 髎 H %4 髎
时，进行 +,-. 质粒 789真核细胞转染，处理 IJ后，
换含 #4髎小牛血清的 -"1D2#%&4 培养液培养 ’GJ，
4 =GF髎胰蛋白酶加 4 = 4&髎 0739消化并收集细胞
用于 -32",-。
# =& = G -32",- 查询 /?*!K*L 数据库 +,-. M
-89序列（9;;?NNO)* 8PMQ?@：R44##G），利用 "@OM?@
S?NO+*?@ < = 4 软件设计上游引物 !"M：F62/9,,92
/9/,33,,3//3/92<6，该引物与前述引物 !"&匹配
用于 -32",-。
按文献［F］的方法抽提已转染了 +,-. 基因组
789的 ,BC2’细胞总 -89，以总 -89为模板，BTO+)2
S3 #G : #I"@OM?@为引物，121(R逆转录酶 <’E作用
<4MO*，UFE作用 FMO* 以合成 ;789 第一链。取 G!T
-3反应产物，以 !"M、!"&为引物，3KLK@K /0 1)2 789
聚合酶按以下条件进行 ",-反应：U&E FMO*；（U&E
#MO*，%FE &FN，’GE #MO*）V GI个循环；’GE #4MO*。
# =& =< -32",-产物的克隆及测序 -32",-产
物的回收、连接、转化及重组克隆的筛选方法同
# =< =<。经酶切及 ",-鉴定后选取正确的克隆进行
测序，克隆编号为 !",。
! ", !"#$ 基因及其编码氨基酸序列分析
!TKNW程序搜索数据库中 +,-. 基因的 0C3、M
-89及氨基酸序列，用 ,(XC39( Y对其进行多序列
联配和聚类分析，研究该基因序列中的 C8"位点分
布状况。
- 结果
- "! )*+抽提及 !"#$ 基因的 ’./0 %1&扩增
外周血中提取的牛基因组 789 B7G%4 $ B7GI4 Z
# =II，凝胶电泳鉴定其 789 分子量 [ GFLQ，无小分
子 789降解。以高纯度、高分子量牛基因组 789
为模板，!"# $ !"%、!"& $ !"’、!"# $ !"& 为引物进行
()*+ ",-扩增，分别得到长约 < =%LQ、F =ILQ和 U =&LQ
的 789片段（图 G），与预期的结果基本相符。
图 G +,-.基因组 789 ()*+ ",-扩增结果
1：#LQ 789分子量标记；#：!"# $ !"%；
G：!"& $ !"’；<：!"# $ !"&
5O+=G 9M.TO\O;KWO)* @?NPTWN )\ Q)]O*? .@)TK;WO* +?*)MO; 789 Q^ ()*+ ",-
1：#LQ 789 MK@L?@；#：!"# $ !"%；G：!"& $ !"’；<：!"# $ !"&
- "- $%&’基因组 )*+全序列的克隆
虽然用引物 !"#和 !"&配对进行 ()*+ ",-扩
增得到了长约 U = &LQ 的序列，但考虑到过长片段
789的 ",-容易形成错配，因此我们采用 !"# : %
（< = %LQ）和 !"& : ’（F = ILQ）两片段拼接的方法克隆
全长 +,-. 基因，使错配产生的几率尽量降低。
",-产物克隆入 ./0123载体，用合适的限制性内
切酶初步鉴定后进行 789 序列测定，结果显示：
!"# : %全长 <%&%Q.，包含 IF&Q. 的 F6端上游调控
区，第一外显子和第一内含子的大部分序列；
!"& : ’ 全长 F’%%Q.，起自第一内含子末端，终于
第五外显子，内含该区域中的所有 789 序列，包
含 <6端 %UQ.的 X3-。!"# : %和 !"& : ’产物借助
单一的限制性内切酶 $%&! !识别位点，将两段序
列连接起来，再通过 !"# # *’() !位点克隆入真核
表达载体 .;789< = # $ >?@)（ A ）中，克隆编号为 !"#
: &，限制性内切酶鉴定结果与预期的一致（图 <）。
对 $%&!!切点接头处测序的结果完全正确，从而
获得完整的全长为 U65 >;>=?616 :@ 9=:;5 "# $ % &
’$：$() *+, A>8(58；’-：!*+,. !"#/ ! A>8(58；
$：$%& "；-：’() "；!：!"#/ !；&：*+,""
! "# !"#$ $%&’序列的克隆
将获得的含有 -./0 基因组全序列的真核表达
载体转染真核细胞 BCDEF 后，经表达通过 4GE#B4
获得长约 HII)J的 9*+,片段（图 &），该片段克隆入
JKL’EG载体后用不同的限制性内切酶鉴定，结果显
示酶切后所产生的条带长度与预期一致（图 M）。测
序结果表明，此 9*+, 序列长度为 HI&)J，涵盖了
-./0 基因的全部 C40 区，与 K5;">;( 数据库中
-./0 基因编码氨基酸序列（,995661:; +71:; 856<=76 :@ ):O1;5
J8:=>971; 9*+, )? 4GE#B4
’：$II)J *+, A>8(58；#：J8:/<97 :@ 4GE#B4
图 M -./0 9*+,克隆 "#B的限制性内切酶分析
’$：$() *+,分子量标记；’-：$II)J *+,分子量标记；
$：$%& "；-：$1% "；!：’2) #；&：.23 #
0123M 456781971:; 5;/:;<9=5>65 >;>=?616 :@
):O1;5 J8:=>971; 9*+, 9=:;5 "#B
’$：$() *+, A>8(58；’-：$II)J *+, A>8(58；
$：$%& "；-：$1% "；!：’2) #；&：.23 #
! "( !"#$ 基因及氨基酸序列分析
本文克隆的 -./0 基因 ,0&-P!$M 编码的氨基
酸序列在 K5;">;( 中的序号为 ,,Q-HIFM，通过
"=>67#搜索，选择与其同源性较高的几条序列做 +ER
聚类分析 3 图 P结果显示，牛与绵羊和山羊 #4Q的
氨基酸序列同源性非常高，达到SS髎，与猪、人、大
鼠和小鼠的同源性分别为 H- 髎、F- 髎、MH 髎和
MM髎。B=<67T多序列联配分析发现，绵羊和山羊与
牛 #4Q氨基酸序列分别只有 - U !个残基的差异，牛
#4Q第 F和 $!H位氨基酸残基为 D58和 ,=>，而绵羊
和山羊则分别为 ,=>和 N=>；牛和绵羊 #4Q第 $S-位
氨基酸残基为 ,6J，山羊为 K=<，自此也表明这些物
种在进化上具有很密切的亲缘关系。
以 ,995661:; +67搜索结果显示，K5;">;( 数据库中收集
有多条 -./0 基因的 A4+,和 LDG序列，各序列间
存在有多个 D+#位点，主要分布于下游编码区和 !V
端的 WG4，以 !V端的 WG4 区域为数最多。已知的
D+#位点有：&-F;7 . B!G，&&-;7 . K!B，&P!;7 . ,!K，
MPH;7 . G!,，PMM;7 . G!B，FPH;7 . B!删除，FF&;7 . ,!
G，FHI;7 . G!K，FS-;7 . G!B，FSF;7 . ,!删除，H$S;7 . G
!删除，HHM;7 . B!插入，等。存在于 )#4Q编码区的
$FFS期 曹 新等：牛催乳素基因组及其 9*+,全长序列的分子克隆和分析
!"#位点均处于编码该氨基酸密码子的第三简并
位，因此皆未改变相应的氨基酸残基的种类和性质。
!"#$ 前体的 $%端信号肽裂解位点具有高度的保守
性，这与人、鼠和家禽的 #&’ 相似［( ) *］。惟一的特
例是序号为 +,(-.,的 /#&’ 0&"1序列，在 *(位碱
基处插入一 213顺序，致使编码该位氨基酸残基的
444序列突变为 421344，由编码一个 356转变为编码
两个氨基酸残基 1578356，但这种插入并未形成常见
的移码突变，仅是在 356之前添加了一个 157残基，
从而形成一种特殊的变异体，对其下游整个 0&"1
的翻译没有产生决定性的影响。
图 ( 催乳素氨基酸序列 259:;75 <程序
"8=种系发生树分析
>?4@( "8= AB65C4DE6 ;FDD 7E756:?: CG AFC57H;?E 70?EC
7H?I :DJ9DEHD: /6 259:;75 <
分析数据库中 !"#$ 基因的 K!L 序列时还发
现，,%端的 ML&内含多个 #5C61位点，检索到的有：
-.(E; N 11L， -*$E; N 323， -*.E; N 31L， *OOE; N 3L2，
*P$E; N L32，*(OE; N 1L3 和 *O.E; N L2L，其中 *O. 位的
L2L位点是决定 0&"1正常翻译、加工的主要位点，
而其他几种隐匿的 #5C61位点则很可能是 !"#$ 变
异体形成的一个重要原因。
! 讨论
/#&’的相对分子质量约 Q$.*Q，初始翻译产物
为 QQ*个氨基酸残基的多肽，P ) ,O位氨基酸残基为
信号肽序列，成熟的多肽含有 P** 个氨基酸残
基［,，PO］。,R ) RP、-- ) QOR、QQP ) QQ* 位氨基酸残基
处形成 ,个二硫键，在整个分子中形成 ,个环状结
构，维持其一定的空间构象。/#&’属磷蛋白家族成
员，内有 ,个磷酸化位点，分别位于 $(、(R、PQO位残
基处［PP］。3DES7ET数据库中目前还未发现有 !"#$
基因组全序列的资料，查询到 , 个不连续的序列
（1HHD::?CE "90/DF分别为
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
的主要目的是通过克隆牛催乳素基
因来研究转基因动物 V乳腺生物反应器。由于在构
建乳腺生物反应器时，对目的基因选择基因组 U"1
抑或 HU"1，多有争议，实验结果也表明某些基因的
基因组和 HU"1序列在同一表达调控体系也存在着
表达水平的差异［PR］。基于此，我们在获得 !"#$ 基
因组全序列后，希望克隆出 /#&’ HU"1。
/#&’ 0&"1在 3DES7ET中已公布，全长 *O./A，
编码阅读框为 (*O/A。!"#$ 基因主要是在牛腺垂体
前叶的泌乳细胞中表达，随血循环进入作用的靶器
官。研究已表明，哺乳动物除腺垂体分泌合成催乳
素，垂体外的很多器官如蜕膜组织、子宫肌、胎盘、羊
水、下丘脑、胸腺、泪腺及淋巴组织等都有 /#&’ 的
合成［,，P$］。在乳腺组织，除由血液中 #&’经乳腺上
皮细胞进入乳汁外（同位素标记 #&’可证实），同时
乳腺组织本身也分泌合成催乳素，因为若用溴隐亭
降低授乳大鼠血浆 #&’并不使乳汁中的 #&’免疫
反应减少。用 "CF;BDFE /5C;，#2&和原位杂交都从妊
娠及授乳大鼠，山羊、绵羊、猪、人类乳腺上皮细胞中
均检测出 #&’ 0&"1，其大小及整个编码区的序列
和垂体表达的 0&"1完全一样［P( ) P-］。
牛的乳腺上皮细胞推测也有 #&’ 的合成和分
泌，但未见文献的报告。为了克隆 /#&’ HU"1，我们
首先选择了孕中期母牛的乳腺组织为实验材料，一
方面想免除对牛脑垂体取材的困难，同时也希望通
过实验证实在牛乳腺上皮细胞能够检测到 #&’ 表
达。但是，&L8#2&始终未能扩增出目的片段。推测
可能有二方面的原因：首先，可能取材时期限制，文
献报告在山羊、绵羊的泌乳期或者在妊娠后期（分娩
前 ,个月内），从它们的乳腺上皮细胞中证实具有
#&’的表达，本实验中材料是来自屠宰场，筛选的乳
腺组织标本为孕中期前的组织（妊娠后期，泌乳期乳
腺组织未能获得）。其次，&L8#2&优化的条件可能
未能达到最佳组合以及乳腺组织还存在很多未知同
Q.. 遗 传 学 报 Q*卷
源基因的表达，使得 !"#$%!特异性不强。实验中
曾对扩增的目的片段构建克隆，然后测序分析，均为
非特异性扩增。虽然我们未能从牛乳腺组织中扩增
出 &$!’ ()*+，但是牛乳腺上皮细胞是否如同其他
哺乳类动物也存在 $!’的合成和分泌，有待更进一
步的确定和研究。
与此同时，我们将 ,%-.启动的 !"#$ 全基因的
,()*+/01（ 2）的真核表达载体按常规方法转染非
洲绿毛猴肾细胞株（%34#5），表达载体在 %34#5细胞
中表达后，通过 !"#$%!成功地扩增到预期的 678&,
目的片段。经构建克隆测序分析，确定该目的片段
与 9:;<=;> 公布的 &$!’ ?!*+ 序列完全相同
（.7711@）。该方法不仅简便快捷，而且直接证实我
们克隆的基因组全长就是 !"#$ 基因，同时也表明
该基因组 )*+序列在转录水平上具有生物学功能，
能够进行正常的表达，这为进一步对催乳素基因表
达调控的基础研究和建立转基因动物 A乳腺生物反
应器奠定了坚实的基础。
*#B聚类分析证明牛与绵羊、山羊、猪、人的 $!’
的氨基酸序列具有很高的同源性，说明这些物种在
进化上具有很近的亲缘关系。随着人们对各物种基
因组序列认识的不断深入，现已知道，即便是同一物
种，不同个体之间存在有大量的 4*$ 位点，这些位
点散在分布于整个基因组序列中。 !"#$ 基因也有
多个 4*$位点，这些位点并没有影响其编码蛋白质
的性质，但很可能在生物体的繁衍、进化、遗传以及
环境适应力等方面则具有重要的意义。另外，除了
$!’的原型外，在生物体内存在一些 $!’ 的变异
型，多推测可能是初始转录物的选择性剪接而造成
的，&$!’ C4"搜索结果进一步证明了这个推论。作
为一种激素分子，各种组织中多种变异型 $!’的存
在，对动物体的生理、代谢、生长、发育以及基因表达
的转录后调控具有非常重要的作用。
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（责任编辑：李绍武）
/55R期 曹 新等：牛催乳素基因组及其 ()*+全长序列的分子克隆和分析
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