有机酸检测的固相萃取方法研究

[基金项目 ]　宁波市医学科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目 (2006048) [作者简介 ]　李小平 (1957 - ) ,女 ,副主任技师 ,主要从事食品质 量安全的检测研究工作。 【论著 】 有机酸检测的固相萃取方法研究 李小平 , 姚浔平 , 陈晓红 , 金米聪 (浙江省宁波市疾病预防控制中心 ,浙江宁波 　315010) [摘要 ]　目的 :建立适宜的食品中有机酸检测的固相萃取方法。方法 :采用高效液相色谱 /紫外法检测 ,就固相萃取小柱 类型、上样溶液 pH值、洗脱剂和洗脱体积等因素对 8种有机酸的回收率影响作了评价比较。结果 :采用 Cleanert SAX固 相萃取小柱 ,方法的相对标准偏差小于 517% ,回收率在 8115% ～10519%范围。结论 :该方法具有快速、简便、准确的优 点 ,可应用于牛奶等食品中有机酸的检测。 [关键词 ]　固相萃取 ; 有机酸 ; 食品 ; 高效液相色谱法 [中图分类号 ]　R15515　　　　[文献标识码 ]　A　　　　[文章编号 ]　1004 - 8685 (2008) 06 - 0981 - 03 Study on determ ina tion of organ ic ac ids by solid - pha se extraction L i X iao2ping, Yao Xun2ping, Chen X iao2hong, J in M i2cong (N ingbo Center for D isease Control and Prevention, N ingbo 315010, China) [ Abstract] 　O bjective: To establish a feasible solid - phase extraction ( SPE) method for the determ ination of organic acids in food1M ethods: The effects of recoveries for the eight organic acids were evaluated by the SPE cartridge types and the value of pH for the loading solution, the composition of eluent and the volume of eluent by a high - performance liquid chromatographic meth2 od with ultraviolet detection1Results: The recoveries were between 8115% ～10519% and the RSD less than 517% when the Cleanert SAX SPE cartridges were used1Conclusion: This SPE method is simp le, rap id, and accurate1 It can be satisfactorily ap2 p lied to the determ ination of organic acids in m ilk foods1 [ Key words] 　Solid - phase extraction; O rganic acid; Food; HPLC 　　固相萃取技术是 80年代中期发展起来的一项样品前处 理技术 ,和传统的样品前处理方法相比 ,固相萃取具有效率更 高、效果更好、容易达到定量萃取、实现快速和自动化等优势。 采用固相萃取技术可以去掉复杂样品中的基质干扰 ,提高样 品纯度和检测灵敏度 [ 1～3 ]。固相萃取技术已较多地用于痕量 分析或基体复杂样品的富集和净化预处理 [ 4～11 ] ,在食品样品 的有机酸测定中 ,由于基体复杂 ,其杂质会干扰测定和污染色 谱系统和色谱柱 ,降低色谱柱的使用寿命。本文就固相萃取 小柱类型、上样溶液 pH值、洗脱剂和洗脱体积等固相萃取主 要影响因素对 8种有机酸测定回收率进行评价比较。利用优 化的条件 ,采用 Cleanert SAX阴离子交换固相萃取小柱对酸奶 样品的有机酸含量进行了测定 ,取得了满意的结果。 1　材料与方法 111　仪器 1100系列高效液相色谱仪 ,包括四元泵 ( G1311A )、在线 真空脱气机 ( G1379A )、紫外检测器 ( G1314A )、柱温箱 ( G1316A)、自动进样器 ( G1313A )和 Chem ical Station色谱工 作站 (美国 Agilent公司 ) ; M illi - Q纯水系统 (美国 M illipore 公司 ) ;MP220型酸度计 (瑞典 Mettler - Toledo公司 ) ; 12管固 相萃取装置 (美国 Agilent公司 )。 112　试剂与材料 磷酸氢二铵 (AR级 ,中国医药集团上海化学试剂公司 ) ; 草酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸 (美国 sig2 ma公司 ) ;乙酸 (HPLC级 ,德国 Merck公司 ) ;实验用水均来自 M illi - Q纯水系统 (美国 M illipore公司 )。Cleanert SAX强阴 离子固相萃取小柱 ( 500 mg/6 m l,美国 Agela公司 ) ; OasisÓ MAX固相萃取柱 (500 mg/6 m l,美国 W aters公司 )。 草酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀 酸标准贮备溶液的配制 (1010 mg/m l) :分别精密称取草酸、酒 石酸、苹果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸 011000 g于 10 m l容量瓶中 ,用水溶解并定容至刻度。 流动相 : 0101 mol/L 磷酸氢二铵 :称取 1132 g磷酸氢二 铵 ,加水溶解 ,并定容至 1000 m l,过 0145μm滤膜。用 20%磷 酸调节 pH至 216,超声脱气。 113　色谱条件 色谱柱 : Gem ini C18 (250 mm ×416 mm i1d1, 5μm) ;柱温 : 30℃;紫外检测波长 : 210 nm;流动相 : 0101 mol/L 磷酸氢二铵 溶液 (pH 216) ;流速 : 110 m l/m in;进样体积 : 1010μl。 114　标准曲线绘制 临用时分别将标准贮备液用水稀释成不同浓度的混合标 准溶液 :草酸 110～400 mg/L、酒石酸 210～500 mg/L、苹果酸 189中国卫生检验杂志 2008年 6月 第 18卷 第 6期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Jun 2008; Vol 18　No 6 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 510～ 1000 mg/L、丙 二 酸 510 ～ 1600 mg/L、乳 酸 310 ～ 2000 mg/L、乙酸 810～2000 mg/L、柠檬酸 510～2000 mg/L、丁 二酸 210～400 mg/L,进样 1010μl,按 113项色谱条件进行检 测 ,以峰面积 (A)对浓度 (C, mg/L)进行线性回归。 115　试样制备 准确称取酸奶样品 510 g于 50 m l比色管中 ,加水定容至 刻度 ,充分混匀 , 6000 r/m in 离心 5 m in,取上清液 110 m l用 5%氨水调至酚酞呈微红色 ,过已活化的 Cleanert SAX阴离子 交换固相萃取小柱 (固相萃取小柱采用 3 m l甲醇、3 m l水活 化 ) ,用 2 m l水淋洗 ,再用 115 m l 6%盐酸淋洗有机酸 ,供 HPLC分析。 2　结果和讨论 211　固相萃取柱的选择 本文试验了 W aters OasisÓ MAX固相萃取柱和 Cleanert SAX固相萃取柱对有机酸萃取的影响 ,对两种萃取小柱作 8 种有机酸的回收率比较 ,结果见表 1。结果表明 8种有机酸的 测定宜用 Cleanert SAX强阴离子固相萃取柱。 表 1　C leanertSAX和 Oa sisÓM AX固相萃取小柱回收率比较 ( %) 小柱类型 草酸 酒石酸 苹果酸 丙二酸 乳酸 乙酸 柠檬酸 琥珀酸 SAX 9711 10010 9518 9617 9210 9810 9417 10210 MAX 3815 5518 3617 3712 3819 4215 5218 3916 212　固相萃取上样溶液 pH及上样体积的确定 本文比较了不同上样体积和不同上样溶液 pH时各有机 酸的回收率 ,结果见表 2。试验表明 ,有机酸在柱中的保留与 上样时 pH有关 ,为使酸性分析物在离子交换柱中保留 ,上样 时用 5%氨水调节样品溶液 pH为 8,酚酞变红色 ,目标分析物 才能达到满意的回收率。随着上样 pH值的增大 ,回收率有增 加的趋势 ,特别是乙酸和乳酸 ,回收率增加较为明显。同时上 样体积在 015～215 m l之间 ,回收率未见明显改变。本研究选 择上样溶液 pH为 8,上样体积为 110 m l。 表 2　不同上样溶液 pH和不同上样体积的回收率比较 ( %) pH值 上样体积 (m l) 草酸 酒石酸 苹果酸 丙二酸 乳酸 乙酸 柠檬酸 琥珀酸 pH = 4 015 8417 9912 6312 10018 2518 818 9516 9618 110 8211 9617 5517 9819 2612 911 9418 9812 215 8311 9811 5515 10118 2312 712 9416 9613 pH = 6 015 9012 10014 8713 9918 4112 1619 9817 9615 110 8617 9618 8512 9613 3918 1712 9715 9812 215 8817 9616 8710 9617 3510 1613 9610 9512 pH = 8 015 10013 10212 9817 9817 9215 9710 9918 10512 110 10018 10213 9719 9519 9216 9813 9519 10213 215 9711 10010 9518 9617 9210 9810 9417 10210 213　洗脱液浓度与体积的确定 实验对洗脱液浓度和体积进行了比较 ,以 110%、410%、 610%的盐酸溶液作为洗脱液 ,洗脱液体积为 110、115 m l时的 回收率见表 3。试验发现用 6%盐酸洗脱 8种有机酸 ,回收率 可达 90%以上 ,洗脱体积以 115 m l为宜。洗脱时将洗脱液停 留在填料上为 1 m in,洗脱速度为 1 m l/m in。 表 3　不同浓度洗脱液及洗脱体积的回收率比较 ( %) 洗脱液浓度 洗脱液体积 (m l) 草酸 酒石酸 苹果酸 丙二酸 乳酸 乙酸 柠檬酸 琥珀酸 1% HCL 110 719 4017 7011 3416 2819 4816 7218 2915 115 811 4113 7014 3416 3613 5218 7513 2918 4% HCL 110 7517 9810 9516 9314 3717 6617 9318 9818 115 8013 9817 9618 9318 9110 9518 9219 10010 6% HCL 110 8113 8617 8717 9011 8812 9213 8219 9417 115 9711 10010 9518 9617 9210 9810 9417 10210 214　回归方程、相关系数及检测限 分别配制不同浓度的有机酸混合标准溶液 ,按本研究规 定的方法进行测定 ,计算出不同浓度的峰面积 ,并进行线性回 归 ,以 3倍信噪比 S/N = 3,计算检测限 ,结果见表 4。 表 4　工作曲线及检出限 组分 线性范围 (mg /L) 回归方程 相关系数 检测限 (mg /L) 草酸 　 110～400 Y = 0141753C + 1125824 019992 015 酒石酸 210～500 Y = 1126625C - 1135160 019999 115 丙二酸 510～1600 Y = 01345749C - 01880611 019997 310 苹果酸 510～1000 Y = 01620678C - 1100720 019999 310 乳酸 　 310～2000 Y = 01342901C - 01071561 019998 110 乙酸 　 810～2000 Y = 01490353C + 2163397 019998 715 柠檬酸 510～2000 Y = 01817985C + 1180565 019998 415 丁二酸 210～400 Y = 2156098C - 1117717 019999 110 215　酸奶样品测定 对市场上采购的 5种酸奶样品进行了有机酸含量的检 测 ,结果见表 5。 表 5　各种酸奶测定结果 ( m g /kg) 伊力酸奶 蒙牛酸奶 宁波酸牛奶 1 宁波酸牛奶 2 双峰香浓原味酸牛奶 酒石酸 - - - - - 苹果酸 - - - - - 丙二酸 - - - - - 乳酸　 12720 1134818 1409015 1340017 1531316 乙酸　 - - - - - 柠檬酸 133011 200911 137518 129310 155013 丁二酸 40412 61310 23012 19815 - 289 中国卫生检验杂志 2008年 6月 第 18卷 第 6期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Jun 2008; Vol 18　No 6 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　由表 5可知 ,酸奶中主要以乳酸和柠檬酸为主 ,同时也含 有一定量的丁二酸 ,但不同品种及产地 ,含量存在一定的差 异。8种有机酸的分离图谱见图 1,酸奶样品的色谱图见图 2。 3　结论 应用固相萃取 HPLC法测定有机酸含量 ,不仅简便、快速 而且精密度高、选择性好、准确度高 ,可作为复杂基体食品中 有机酸的分析方法。 [参考文献 ] [ 1 ] 张海霞 ,朱彭龄 1固相萃取 [ J ] 1分析化学 , 2000, 9 ( 28) : 1172 - 11801 [ 2 ] 张颖 1生物样品预处理技术及应用进展 [ J ]1天津药学 , 2006, 18 (1) : 56 - 581 [ 3 ] 庄苒 1固相萃取技术及其在体内药物分析中的应用 [ J ]12007, 19 (8) : 115 - 1181 [ 4 ] 金米聪 , 马建明 , 龚文杰 1尿液中华法灵的高效液相色谱法测定 [ J ]1中国公共卫生 , 2006, 22 (7) : 8871 [ 5 ] 陈晓红 , 仇佩虹 , 金米聪 , 等 1固相萃取 - 高效液相色谱柱后衍 生法测定水中痕量 N -甲基氨基甲酸酯 [ J ]1中国卫生检验杂志 , 2006, 16 (1) : 9 - 111 [ 6 ] MC J in, YP Ren, XH Chen1Determ ination of 6 - benzyladenine in bean sp rout by LC - ESI - IT - MS/MS[ J ] 1Chromatographia, 2007, 66 (5～6) : 407 - 4101 [ 7 ] 李小平 , 蒋经伟 , 范建中 , 等 1固相萃取 HPLC法测定豆芽中 4 - 氯苯氧乙酸钠 [ J ]1中国卫生检验杂志 , 2006, 16 (3) : 267 - 2691 [ 8 ] MC J in, YW Yang1Simultaneous determ ination of 9 trace mono - and di - chlorophenols in water by ion chromatography atmospheric p ressure chem ical ionization mass spectrometry [ J ] 1Anal Chim Acta, 2006, 566 (2) : 193 - 1991 [ 9 ] 金米聪 , 颜勇卿 , 陈晓红 , 等 1离子色谱 - 质谱联用法同时测定 饮用水中 3种痕量一氯酚研究 [ J ] 1分析化学 , 2006, 34 ( 9 ) : 1223 - 12261 [ 10 ] 金米聪 , 马建明 , 陈晓红 , 等 1饮用水中 3种一氯酚异构体的液 相色谱 - 质谱联用法测定研究 [ J ] 1中国卫生检验杂志 , 2006, 16 (5) : 519 - 5211 [ 11 ] 金米聪 , 陈晓红 , 李小平 , 等 1高效液相色谱 - 电喷雾电离质谱 联用法测定水中痕量五氯酚研究 [ J ] 1中国卫生检验杂志 , 2005, 15 (3) : 280 - 281, 2861 (收稿日期 : 2008 - 02 - 15) (上接第 977页 ) 215　样品测定 精密称取样品约 10 g,平行 2份 ,按本法进行提取、净化、 浓缩后进行气相色谱测定 ,测得各样品中所含残留农药的峰 面积 ,代入线性回归方程计算样品中农药残留量。同时平行 称取不同样品 6份 ,按国标 GB /T5009120进行测定 ,所有样品 均未检出 ,两种检测方法结果一致 ,未发现显著性差异。本次 实验对收集的 4个杨梅基地 ,共 40个批次样品中有机磷农药 残留量进行了测定 ,并对检测结果进行了分析。结果发现 ,宁 波地区不同基地的杨梅在所检测的 22种有机磷农药中均未 检出。 3　小结 本文采用 V (乙腈 ) : V (丙酮 ) = 4: 1的混合溶剂匀浆提 取 ,经 Envi - Carb柱和 Sep - Park氨丙基柱净化浓缩后 ,用 FPD检测器 ,建立了杨梅中 22种有机磷农药残留同时测定的 气相色谱方法 ,同时对宁波地区 4个杨梅基地 ,共 40个批次样 品中有机磷农药残留进行了测定。这 22种有机磷农药在给 定色谱条件下能达到良好分离 ; 方法检测限在 01005 ～ 01015 mg/kg,方 法 的 回 收 率 在 70% ～ 95% ; 在 012 ～ 2010μg/m l的范围内有良好的线性关系 ;宁波地区不同基地 的杨梅在所检测的 22种有机磷农药中均未检出。 [参考文献 ] [ 1 ] 刘红丽 ,苏永恒 ,翟志雷 1蔬菜、水果中有机磷农药多残留同时测 定的气相色谱法研究 [ J ]1中国卫生检验杂志 , 2007, 17 (1) : 8 - 91 [ 2 ] 刘敏 ,端裕树 , 宋苑苑 ,等 1分散固相萃取 - 液相色谱 - 质谱检测 蔬菜水果中氨基甲酸酯和有机磷农药 [ J ] 1分析化学 , 2006, 34 (7) : 941 - 9451 [ 3 ] 刘咏梅 ,王志华 ,储晓刚 1凝胶渗透色谱净化一气相色谱分离同时 测定糙米中 50种有机磷农药残留 [ J ] 1分析化学 , 2005, 33 ( 6 ) : 808 - 8101 [ 4 ] 杨云 ,张卓雯 ,李攻科 1微波辅助萃取 /气相色谱质谱联用分析蔬 菜中的有机磷农药 [ J ]1色谱 , 2002, 20 (5) : 390 - 3931 [ 5 ] GB / T19648 - 20061水果和蔬菜中 500种农药残留及相关化学品 残留量的测定 [ S]1 [ 6 ] 柳洁 ,何碧英 ,孙俊红 1固相萃取 GC /MS法测定血中 25种有机磷 农药的方法研究 [ J ]1现代预防医学 , 2005, 32 (9) : 1240 - 12441 [ 7 ] 李继革 ,周凯 ,戚双祥 1气相色谱法测定蔬菜中 10种有机磷农药 [ J ]1中国卫生检验杂志 , 2005, 15 (3) : 306 - 3071 [ 8 ] 程雪梅 1色谱分析样品前处理技术 - 固相萃取法 [ J ] 1热带农业 工程 , 2002, (1) : 14 - 161 [ 9 ] 史坚 1现代柱色谱分析 [M ] 1上海 :科学技术文献出版社 , 1988: 1201 (收稿日期 : 2007 - 12 - 10) 389中国卫生检验杂志 2008年 6月 第 18卷 第 6期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Jun 2008; Vol 18　No 6 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. 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